1.1立题依据

β-内酰胺抗生素是临床应用中最为广泛的一类抗生素，市场前景广阔。相对化学合成而言，生物合成更受青睐[8]。生物酶合成或半合成β-内酰胺抗生素的经济和环境利益优于传统的化学合成过程，其中，固定化青霉素酰化酶（PGA）被广泛应用于β-内酰胺抗生素合成研究中，所以选取固定化青霉素酰化酶（PGA）作为反应催化酶。在动力学酶合成头孢羟克洛过程中，固定化青霉素酰化酶(PGA)催化了3个不同的反应：合成头孢羟克洛，水解4-OH-PGME和水解头孢羟克洛[9-11]。在酶催化合成过程中，对反应条件的优化控制尤为重要，包括pH、温度、反应时间、母核侧链投料比以及选择作为催化作用的酶等因素，这些因素直接影响到头孢母核7-ACCA的转化率[12]。

图1 酶法合成头孢羟克洛的路线

Fig1 The general scheme for IPA catalyzed synthesis of cefaclor-hydroxyl

2  实验部分

2.1实验材料

7-氨基-3-氯-头孢烯酸（7-ACCA）湖北鑫源顺医药化工有限公司；D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐（4-OH-PGME）深圳博泰尔生物技术有限公司；青霉素G钾盐 湖南福来格生物技术有限公司；固定化青霉素酰化酶（PGA）湖南福来格生物技术有限公司；对二甲氨基苯甲醛 南京化学试剂有限公司；磷酸钾缓冲液(KPB) 江苏强盛功能化学股份有限公司；95%乙醇 南京化学试剂有限公司；氨水 无锡市亚盛化工有限公司。

2.2实验仪器

CPH-1A pH自动控制加液机(长沙克罗玛医药科技有限公司)；DL-4005 改装低温冷却液循环泵（上海比朗仪器有限公司）；JJ-精密增力电动搅拌器（江苏金坛佳美仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（上海精研）；BS224S、TE612-L电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Boro3.3 生物反应器（上海玻璃仪器厂订制）。

2.3实验方法文献综述

2.3.1头孢母核7-ACCA标准曲线的绘制

取反应液0.1 mL，加入0.4 mL的95%乙醇终止液，充分混匀后取0.1 mL终止液，稀释5倍后加入PDAB生色液3.5 mL，混匀静置5 min后，在波长415 nm条件下测定吸光度A415。其中显色液PDAB配置：称取0.25 g对二氨基苯甲醛溶于50 mL甲醇中，加入40 mL乙酸和2M NaOH 2.5 mL的混合液，加蒸馏水稀释至350 mL，置棕色试剂瓶保存。

2.3.2酶的稳定性实验

取8只具塞试管，加入5 mLpH6.0 KPB缓冲液，分别称取0.2 g固定化青霉素酰化酶加入8只试管中，将振荡水浴锅的温度设定到25℃，待水浴锅温度达到目标温度后，把这8只试管依次垂直放入水浴锅中。取出第一只试管，记下此时的时间，将第一只试管中的酶抽滤出来，并称取0.1 g备用。

取2只具塞50 mL三角瓶，称取0.24 g青霉素G钾盐，倒入第一只三角瓶中，并加入6 mLpH6.0KPB，搅拌溶解。把备用的0.1 g酶倒入第二只三角瓶中，改好瓶塞，放入25℃水浴锅中预热5 min后取出。从第一只三角瓶中吸取5 mL加入第二只三角瓶中，盖好瓶塞放入25℃水浴锅中，计时5 min后取出，向三角瓶中加入5 mL 95% 乙醇终止反应。

取三只试管，第一只试管中加入5 mL纯水和3.5 mL PDAB，第二只试管中加入0.1 mL终止液和0.4 mL纯水和3.5 mL PDAB，第三只试管中加入0.2 mL终止液和0.3 mL纯水和3.5 mL PDAB，混匀，静置5 min后测吸光度（OD）值。酶活定义为：在pH 6.0，25℃条件下每分钟催化青霉素G产生1 μmol的6-APA所需的酶量为一个单位（IU）。

根据公式：

算出酶活，其余7只试管每隔24小时按照上述方法测出酶活。