3  结果与讨论 13

3.1  重组内切葡聚糖酶纯化过程参数和不连续SDS-PAGE凝胶电泳 13

3.2  纯化重组内切葡聚糖酶的最适温度和热的稳定性 14

3.3  纯化重组内切葡聚糖酶的最适pH值和对pH的稳定性 15

3.4  金属离子对重组内切葡聚糖酶酶活的影响 16

3.5  动力学常数Km和最大反应速度Vmax 16

结论 18

参 考 文 献 19

致谢

1  前言

    纤维素是生物界最重要的碳源物质,是地球上数量最多的可再生自然资源,可不断通过光合作用得以补充[1]。纤维素的利用目前尚未完全开发，造成资源及能源的巨大浪费。而纤维素没有被合理有效地利用，其根本原因是当前已发现的纤维素酶具有生产成本高、酶组分结构不合理及催化效率低等特点[2]。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称,在食品、饲料、医药、纺织、洗涤剂和造纸等工业领域具有广泛的应用价值。从酶的作用特性出发可分成2大类:碱性纤维素酶和酸性纤维素酶。根据其作用方式一般又可将纤维素酶分为3类:外切β-1,4-葡聚糖苷酶(简称CBH)、内切β-1,4-葡聚糖苷酶(简称EG)和β-1,4-葡萄糖苷酶(简称BG)。在这3种酶的协同作用下,纤维素最终被分解成葡萄糖[3-5]。在纤维素酶系中，内切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4）是主要成分，不同菌株或同一菌株由于培养条件、发酵条件的不同，所产生的内切葡聚糖酶的分子量、等电点、酶学特性及分子结构也会有所区别[6]。论文网

近年来国内外学者已经对里氏木霉产生的内切葡聚糖酶EGII进行了广泛的研究，将该酶基因在酿酒酵母中表达，但其表达的酶活力很低，不到1U/ml[7]；将该基因在巴斯德毕赤酵母中表达其表达的酶活却有很大的改观，达到1573U/ml[8]，为内切葡聚糖酶工业化生产奠定良好的基础，并激发了各研究者们对重组内切葡聚糖酶的酶学性质更加热切的研究[9]。

马克斯克鲁维酵母是目前研究较为广泛的一种非传统酵母，因其耐高温、能量损耗低、生长速率快、染菌机率低、底物谱广等诸多优势而越来越多地应用于工业生物技术领域[10]         

马克斯克鲁维酵母可以分泌菊粉酶、β-半乳糖苷酶等多种应用广泛的水解酶类[11]；还可以利用菊粉类原料、乳清、糖蜜以及木糖等多种非粮底物生产乙醇；其在外源蛋白的分泌以及基因工程操作等工业分子生物学领域也取得了突破。文献综述

总而言之，相比传统酵母,马克斯克鲁维高温酵母具有良好的耐温适应能力、更宽泛的底物利用能力、良好的发酵性能、超强的分泌能力、适于分子生物学操作等优势。

    本实验利用前期工作中成果，即对成功构建的重组马克斯克鲁维酵母进行发酵培养并对其产生的重组目的酶即内切葡聚糖酶进行分离纯化以及进一步的酶学性质研究。

2  材料与方法

2.1  材料 

2.1.1  主要仪器和设备

2S-75HJ型高压灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司

SW-CJ-IFD型单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司

HD-930型组合式全温摇床：太仓市博莱特实验仪器厂

电子天平BS210S：北京赛多利斯天平有限公司