2。10。 35S超表达载体的构建 13

3。 结果与分析 13

3。1。 总RNA的提取 13

3。2。 苦蘵不同组织的RNA提取 14

3。3。 cDNA质量检测 15

3。4。 两个代表性的CHS家族基因全长序列的克隆 16

3。5。 35S超表达载体的构建 16

4。 讨论 17

4。1。 苦蘵CHS基因组织差异性表达与次生代谢的关系 17

4。2。 苦蘵CHS基因可能的应用前景 17

参考文献 18

前  言

【研究意义】苦蘵（Physalis angulata L。）又称灯笼草。茄科、酸浆属，多年生草本，常生于灌丛中以及草丛中。出自《本草纲目拾遗》；①《尔雅》郭璞注：“蘵草，叶似酸浆，花小而白，中心黄，江东以作葅食。”②《纲目》：“酸浆、苦蘵，一种二物也，但大者为酸浆，小者为苦蘵，以此为别。败酱亦名苦蘵，与此不同。”苦蘵根状茎横卧或斜生，节处生多数细根；它的茎直立，颜色为黄绿色至黄棕色，有时带淡紫色，茎下部常带脱落性倒生白色粗毛，上部通常无毛或有些倒生稍弯糙毛，或有2列纵向短糙毛。苦蘵的常作为药用植物来使用，能治疗感冒，肺热咳嗽，咽喉肿痛，龈肿，湿热黄疸，痢疾，水肿，热淋，天疱疮，疔疮，肺痈，腮腺炎；小便不利，血尿等。另外，备受重视的还有苦蘵带有一定的抗癌作用。苦蘵全株乙醇提取物中分别得到酸浆苦味素F(I)和D(II)。化合物I在体外试验中对5种人肿瘤细胞株(肝癌HA22T、宫颈癌HeLa、鼻咽癌KB、直肠癌Colo-205、肺癌Calu-1)和3种动物肿瘤细胞株(黑素瘤H1477、喉表皮癌Hep-2、神经胶质瘤8401)有效，其中抗肝癌作用最强，对HeLa细胞作用次之。在小鼠淋巴细胞白血病P388体内试验I也表现出抗癌活性。而化合物II体内、体外皆无效[1]。论文网

类黄酮（flavonoids）化合物作为一种具有较强生物活性的次生代谢产物，广泛存在于植物的叶、花、果中，是一组天然色素前体物，因为其多呈黄色而被称为生物类黄酮。生物类黄酮具有抗氧化、抑制脂质过氧化反应、预防心血管疾病、防癌等的作用[2]。根据大量研究显示，查尔酮合成酶（CHS）和异构酶（CHI）是类黄酮合成途径中至关重要的两个酶，与植物育性、抗逆性密切相关（Taylor and Jorgensen，1992； van der Meer et al。， 1992；Yu et al。， 2005）[3]。查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS) 是世界上第1例从经紫外线辐射的欧芹悬浮培养细胞中分离的类黄酮生物合成基因 ，目前EMBL数据库中有来自于19个科8O多个CHS基因编码区全序列[12]。不同植物之问，CHS基因的编码区比较保守，长约1。2kb，不同科间DNA的同源性达6O％以上[4]。不仅是编码区，查尔酮合酶的基因结构和编码区一样保守，曾有报道说明，除了金鱼草中的一个CHS基因AMCHS含有两个内含子外，其余的都仅有1个内含子，而且这个内含子的位置和在已发现的序列中的位置均相同，即位于第65位(以欧洲赤松的PSCHS为标准)的半胱氨酸密码子内第1和2位碱基之间，其长度从几十碱基对到几千碱基对不等。外显子1编码约57～64个氨基酸，外显子2编码约340个氨基酸，对CHS基因外显子2氨基酸序列进行排序，结果表明，CHS基因的外显子2比较保守，没有大的插入、缺失突变，科间氨基酸同源性一般在7O％以上[5]。CHS基因在参与类黄酮生物合成途径中起至关重要的作用，它催化丙二酰CoA与对羟基苯丙烯酰CoA生成的四羟基查耳酮是类黄酮类化合物的基本碳骨架，是一个重要的中间产物[6]。