查尔酮合成酶在次生代谢途径中的位置

The position of chalcone synthase in the secondary metabolism pathway。

【基因克隆】基因克隆技术主要是指通过体外重组，将目的基因片段（DNA序列）插入特定载体，然后转入受体细胞，使目的基因扩增并最终表达成蛋白质，从而对目的基因的生物学特性等进行进一步研究[7]。它诞生于二十世纪70年代初期，并且在之后得到了迅猛的发展，为了满足不同研究需求，各种克隆方法应运而生，并且每一种基因克隆方法都在不断地发展和完善。研究者们可以通过基因克隆技术获得某些具有特殊功能的目的基因序列，然后再结合其他分子生物学技术对目的基因的功能及特性进行进一步的研究。

基因克隆技术的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，它主要包括分、切、连、转、选五个步骤：（1）分是指分离制备合格待操作的DNA，也称作目的基因的获取，基因克隆方法的分类主要就是根据获取方式的不同来分类的。（2）获取目的基因后，要转入受体细胞中必须要借助能够携带外源基因的载体，如细菌质粒等，它们常常具有自主复制和转录能力，已保证能在受体细胞中表达所携带的遗传信息，切便是用特异的限制性内切酶将适用的载体切开。（3）连就是将目的基因与载体用DNA连接酶连接起来，形成重组的质粒。连接一般分成粘性末端连接和平末端连接这两种，连接的意义是以获得重组质粒为前提和条件，只有目的基因成功与载体连接，才能够使得目的基因在重组质粒导入受体细胞后成功的翻译并表达。（4）转是指用特定方法将重组质粒导入受体细胞，我们通常所说的转化(transformation)就是导入原核细胞的过程，转染(transfection)是导入真核受体细胞的过程，而转导(transduction)则是由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。（5）选即对获得的重组子进行筛选，从受体中挑选出携带正确重组质粒的个体 ，主要方法有蓝白斑筛选法、限制酶酶切法、免疫筛选法以及PCR筛选等。目前，常用的基因克隆方法有：功能克隆、图位克隆、基因芯片、文库法、表达序列标签等[8]。

【前人研究进展】作为植物色素沉积中的花青素、原花青素、鞣红等多酚色素的合成，需要通过黄酮类物质合成途径完成[9]。CHS基因的表达能被光照、生理钟、低温、BA和GA3 、脯氨酸及碳水化合物、P蛋白等所调节。“CHS基因的表达也是与其它基因相互作用的结果。CHS基因可以在花中特异性表达，其表达量的改变可能导致植物花色的变异。”研究发现水稻中CHS基因的异常表达将会导致花粉败育（张弢，2012），因此推断CHS基因或许可以控制植物中花色素和花粉的形成[9]。目前，将CHS基因导入植物中以提高植物抗逆性已成为新的研究热点。例如将CHS基因转化至番茄后，通过改变其表达量可调节番茄果肉组织中黄酮醇的合成，从而提高番茄的抗氧化水平（王燕等，2007）。最新研究表明，将CHS基因导入杨树，改变其表达量可降低转基因杨树对低温的敏感性[10]。文献综述

【本研究切入点】目前植物基因工程技术逐渐成熟，被广泛应用到各个领域，通过TA克隆可以获得基因序列，为进一步了解CHS基因功能奠定了基础[11]。苦蘵药用价值非常高，以其果、根或全草入药；夏秋采集，鲜用或晒干。其主要功效为清热解毒，消肿利尿。而与拟南芥、矮牵牛等作物相比，目前有关在苦蘵中的CHS基因研究却比较少见。

1。 研究材料

1。1。 实验材料

苦蘵材料取自浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点实验室的温室大棚中，大肠杆菌取自本实验室保存菌种DH5α，超表达载体pDL28HA，克隆载体pMD19-T采购自TaKaRa公司，它的结构为：