2。3。3。1感受态细胞的制备 6

2。3。3。2质粒的转化 7

2。3。4使用的菌株与质粒 7

2。3。5 重叠引物延申PCR 7

3 在血红蛋白β亚基引入点突变及构建其表达载体 8

3。1 pETDuet1HBβ 质粒的构建 8

3。1。1  突变引物的设计 8

3。1。2  用重叠引物延伸PCR突变法在血红蛋白β亚基引入点突变 9

3。1。3  将带有突变的DNA片段克隆至载体pETDuet1 10

3。1。3。1 将pETDuet-1载体与引入突变的血红蛋白β亚基连接 10

3。1。3。2质粒的转化 11

3。1。3。3从细菌中提取质粒，将新构建的质粒命名为：pET Duet1 HB 11

3。1。3。4。 pET Duet1HB作为模板PCR扩增血红蛋白β亚基DNA片段 12

3。2 讨论与展望 13

参考文献 14

致谢 15

1 绪论

1。1 引言

 在临床实践中，输血对于挽救生命非常重要。调查显示，每年世界的输血量递增速率特别快,大约是每年700万升[1]。美国到2030年血液短缺量将达到400万个单位[2]。而我国的血液供求的矛盾也很突出。从2012 年输血和采血数据就可以发现，两者之间差距仍然很大[3]。文献综述

二战中近50％以上的人员因为没有得到及时的输血抢救而死亡[4]。不光如此，很多自然灾害造成的人员损伤也是因无法及时输血抢救而死亡。

此外，传统输血过程中存在很多问题，比如交叉感染、输血前需要配血型等，使输血的手段受到了很大的限制[5]。

血代品研究的兴起与20世纪80年代HIV的发现息息相关[6]。血液替代品一般都是纳米颗粒的分子，能够通过由于“心梗”或“脑梗”局部堵塞而红细胞不能通过的血管，对于治疗这两种严重危及生命的疾病治疗有极大的意义。

1。2 血代品 

     血代品（Blood Substitution）即血液替代品，也叫做人工血液（Artifical Blood）。它跟人血液一样，也可以输送氧气，进行气体交换等。但是，血液的成分比较复杂，所以想制造出完全可以取代血液的溶液还是很困难的。目前人工血液通常指红细胞替用品 [7]。 

1。3血红蛋白及其氧载体

 血红蛋白（Hemoglobin，HB）占红细胞总蛋白量的90％。是一个由两对亚基组成的四聚体分子（如α2β2），分子质量为64500Da。

血红蛋白是由珠蛋白和血红素结合而成的色素蛋白。它能够可逆地与一些气体分子（如O2、CO等）结合[8]，所以它有强大的运氧功能。

  将血红蛋白溶液用作红细胞代用品被称作血红蛋白氧载体（Hemoglobin-based oxygen carriers）。目前，研究者们主要是利用化学修饰的方法处理血红蛋白。其目的是使血红蛋白分子四聚体更加稳定，不易降解成二

聚体。二聚体因分子量变小，可以迅速经过肾脏排出去[9]，不仅有肾毒性，而且能引发高血压。所以我们研究的重点就是要增加血红蛋白体积，或者让血红蛋白更加稳定。此外，血红蛋白氧载体由于不在红细胞中，2，3-二磷酸甘油酸来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com