浓度很低，使得血红蛋白氧载体对氧的亲和力高，不利于在需要组织中对氧气的释放。因此，研究血红蛋白氧载体的一个重要课题就是如何将血红蛋白对氧的亲和力降低。

目前主要有三类氧载体：（1）化学修饰Hb，（2）含酶类的红细胞和微包囊Hb，（3）分子遗传工程Hb[10]。

本项目的最终目的是用重组技术生产大分子量的白蛋白-血红蛋白融合蛋白，并在血红蛋白分子引入点突变，降低其对氧的亲和力。

1。4本课题设计方案

 利用基因重组和重叠延伸PCR的技术手段，构建带有突变位点的表达血红蛋白β亚基的原核表达载体。具体的方法，选取原核表达载体pETDuet-1，根据载体上的酶切位点设计引物，将β基因克隆出来。设计带有突变位点的两个引物，通过重叠延伸PCR在血红蛋白β亚基引入突变。最后将带有突变位点的血红蛋白β亚基DNA片段与表达载体pETDuet-1分别用同样的酶切并连接，获得重组表达质粒pETDuet1HBβ。

2 实验设备、耗材和试验方法

2。1实验设备和试剂

2。1。1仪器和设备

   DYY-8C电泳仪 DK－8B电子恒温水浴锅

    TGL-16B高速微量离心机

    LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 QL-901漩涡振荡器

HJ-1磁力恒温搅拌器 DT502电子天平

JL1003分析天平 A00915 PH酸度计

BCM-1300-U生物洁净工作台

    Gilson单道移液器

    LG2000凝胶成像系统

2。1。2试剂

试剂名称

冰乙酸、乙醇、氯化钠、乙酸钾、葡萄糖

Tryptone、Yeast Extract

Agarose

琼脂粉

硫酸卡那霉素、SDS、IPTG、Glycine、NaOH、

浓盐酸

Tris

EDTA-Na。2H2O、Bromophenol blue、Xylene Cyanol FF

UV-7504紫外可见分光光度计

pETDuet1质粒、DH5α菌株

2。2 培养基和溶液的配制

2。2。1 LB（Luria-Bertani）培养基的配制

调pH=7。0。去离子水定容至1L。121℃下20 min高压锅蒸汽灭菌。

2。2。2 溶液的配制

2。2。2。1 抽提/裂解缓冲液和溶液

碱裂解溶液I（P1）

碱裂解溶液II（P2）

碱裂解溶液III（P3）

2。2。2。2 电泳和凝胶加样缓冲液

50×TAE Buffer

6×DNA Loading Buffer

2。2。3  DNA琼脂糖凝胶的制备

2。2。3。1 1%琼脂糖凝胶 

2。3试验方法

2。3。1 DNA限制性核酸内切酶反应 

     本实验主要使用两种限制酶：NcoI和BamHI。 DNA限制性酶切

2。3。2 质粒的微量提取与验证