本研究采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术，以土壤线虫和外来入侵植物互花米草作为研究对象，快速、简便、高效地比较分析土壤线虫群落谱系结构和遗传多样性在互花米草和芦苇或红树林间的差异，揭示我国滨海湿地互花米草的入侵对土著底栖线虫遗传多样性的影响，为我国海岸带湿地生态环境的保护、监测、生态修复提供科学的依据。

2 材料与方法

2。1 样品采集

基于对我国滨海湿地分布状况的前期调查，我们沿我国海岸线从南到北选取福建漳州、浙江温州、上海崇明、江苏盐城、天津滨海5个地点（见表1），选择潮间带滩涂、由红树林或芦苇和互花米草单物种群落覆盖的潮间带盐沼湿地作为样品采集生境。文献综述

在所选取样地内，利用样线法采集底泥。我们于2014年6-8月份期间进行野外采样。如图在每个样地中，设置3条长8m的平行样线（距离植被边缘≧2m），相邻样线间隔50m，在每条样线上，每隔2米取5×5cm深10cm的土柱，混合5个土柱为一个样品（composite sample）

表1 样品采集详情

采样地 经纬度 植被 样品名

福建省漳州市竹塔红树林保护区 23°44′ N, 117°32′ E 红树林 F-M

互花米草 F-S

浙江省温州市乐清湾西门岛 28°20′ N, 121°10′ E 红树林 Z-M

互花米草 Z-S

上海市崇明岛 31°30′ N, 121°55′ E 芦苇 S-P

互花米草 S-S

江苏省盐城市大丰港 33°11′ N, 120°43′ E 芦苇 J-P

互花米草 J-S

天津市滨港新区天津港 39°03′ N, 117°41′ E 芦苇 T-P

互花米草 T-S

2。2土壤线虫的分离

土样带回实验室后，称取20g左右的土样，烘干至恒重以估算含水量；称取150g鲜土样，结合蔗糖悬浮法和科布过筛法浓缩线虫样品。得到的线虫原液用98%乙醇保存，用于PCR-DGGE分析。

2。3 PCR-DGGE分析

线虫基因组提取采用由ZYMO RESEARCH公司生产的ZR Insect & Tissue DNA Kit-25TM(50 preps。)。通过查找资料和前期预实验，我们选择使用通用引物SSU18A-SSU9R/GC来进行本实验的基因扩增，它们是由Blaxter等（1998）设计并常被用来分析土壤线虫群落的经典引物对。

正向引物SSU18A： 5′-AAA GAT TAA GCC ATG CAT G-3′

反向引物SSU9R:  5′- AGC TGG AAT TAC CGC GGC TG-3′

我们在正向引物的5′端链接一个GC发夹结构：5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC G -3′。GC夹子利用的是“G与C之间有三个氢键”这一稳定结构，它能在变性剂中保持相对的稳定性而不被解链，从而达到使被检测基因片段不同程度地解链，最终在一定的变性剂浓度梯度中分离。

线虫PCR-DGGE扩增反应体系30 μL（产物：590 bp），包括灭菌去离子水 1。5 μL；2×Phata Max Buffer  15 μL；5×PCR Enhancer，6。0 μL；dNTPs(10mM)，0。6 μL；SSU18A (10μM)，0。9 μL；SSU9R-GC (10μM)，0。9 μL；Phata Max酶，0。6 μL；纯化线虫基因组DNA模板， 4。5 μL。PCR扩增反应条件为：预变性在95℃下3min；38个循环分别在95℃，15sec；58℃，15sec；72℃，30sec；彻底延伸在72℃下5min。来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*