Solution A: 22。79 g 氯化钠,3。98 g 硫酸钠,0。72 g 氯化钾,0。27 g 氯化铵,47。2 mg 磷酸氢二钠,83 mg 溴化钠,31 mg 碳酸氢钠,27 mg硼酸,2。6 mg氟化钠,1。3 g TAPSO,890 ml蒸馏水,调节pH至7。6,高温高压灭菌;Solution B:11。18 g 六水合氯化镁,1。46 g 二水和氯化钙,24 mg 六水合氯化锶,100 ml 蒸馏水,高温高压灭菌;Solution C:0。02 g 四水合四氯化铁,100 ml 蒸馏水,G6玻璃砂漏斗过滤灭菌[7];海水无机液体培养基:890 ml Solution A,100 毫升 Solution B,10ml Solution C;海水营养液体培养基:890 ml Solution A,100 毫升 Solution B,10 ml Solution C,2 g/L 胰蛋白胨,1 g/L 酵母提取物;海水营养固体培养基:890 ml Solution A,100 ml Solution B,10 ml Solution C,2 g/L 胰蛋白胨,1 g/L 酵母提取物,2%琼脂粉。含有萘的培养基(以萘作为唯一碳源):将萘融于丙酮,过滤除菌,然后加入基础培养基中,萘浓度为20mg/L。

1。1。3 菌株的分离纯化 

取样品海水20毫升加入到以萘为唯一碳源的海水无机液体培养基中,设定摇床条件:250 r/min,温度35℃,48h。重复上述步骤3次。培养3代后,逐级梯度稀释菌液,在超净台中取200微升菌液分别涂布到海水营养固体平板上。35℃恒温箱静置培养,至菌落长成。挑取平板上长出来的单菌落,在含有萘的固体平板上进行三区划线培养,经过多次三区划线培养后,得到纯化菌株单菌落;最终挑取单菌落,接种到以萘为唯一碳源的海水无机培养基中,设定摇床条件:250 r/min,温度35℃,48h。培养液变浑浊,得到菌株LYG16。培养得到单菌落后一部分用无菌超纯水洗脱,用40%甘油在-70℃以下超低温保存备用,另一部分的单菌落继续培养用于实验研究。

1。2 实验方法

1。2。1 菌落形态观察、鉴定 

取分离纯化后的菌种以萘为唯一碳源的海水无机培养基中上划线,置于35℃恒温箱中培养,等到细菌生长至对数生长期之后,菌落大小稳定,观察菌落形态,对菌落的状态进行描述。并取上述的细胞,进行扫描电子显微镜观察,细菌细胞形态,确定其是否有鞭毛,并测定菌体大小。接着对菌株进行革兰氏染色,在10 X 40倍光学显微镜下观察,鉴别细菌。

1。2。2 菌株的生理生化特性 来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

底物的利用:以海洋无机培养基为基础培养基,另外包括Biology通用的碳源的糖、醇、酸作为唯一碳源,检测菌株的生长情况[14]。

1。2。3 对16S rDNA基因的进行PCR扩增 

挑取平板上的单菌落配制成菌悬液,用加热煮沸法破坏细菌的细胞壁,用上海生物工程有限公司的PCR扩增试剂盒对LYG16菌株的16S rDNA进行扩增,PCR试剂使用配方如下表1所示,其中上游引物为Escherichia coli bases 8 to 27: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,下游引物为Escherichia coli bases 1507 to 1492: 5’-TACCTTGTTACGACTT -3’ [15]。50微升体系PCR试剂使用量与PCR条

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