2。3两种参照基因下HSP基因的表达量 12

2。3。1 Rpli3A下突变体表达量变化 12

2。3。2 EF1A下突变体表达量变化 14

2。3。3 Betaactin下突变体表达量变化 15

2。3。4 Betaactin2下突变体表达量变化 16

3  讨论 17

3。1 研究意义 17

3。2不同参照基因对于HSP基因在突变体氧化压力下表达量计算的影响 18

3。3RNA质量对实验科学性的影响 18

参考文献： 18

致谢 19

引言

荧光标记技术的应用和新器材导致了实时荧光定量反转录PCR方法的发展，这使得转录组水平的实时定量检测成为可能。不同于传统的PCR只能检测最后的反应表达量，实时荧光定量反转录PCR可以边扩增边检测表达量。它提供一个快速自动化的多转录本水平的检测，兼具高敏感，高产量，和一个相当大的灵活范围。一个常见的标准化实时荧光定量反转录PCR获得数据的方法是同时扩增内源基因，或者一个管家基因。理想化的情况下，这种参照基因应该在所有样本表达一致，例如，不同组织，在所有发育时期，实验操作前后都是一致的。

实时荧光定量反转录PCR最近被用于基因表达研究，它通过PCR扩增过程中荧光信号的变化对整个PCR进程进行检测，实时反映扩增轮数中对象基因表达量的变化。它的出现弥补RNA-Sequencing技术对于基因表达量鉴定有时有误差的缺憾。目前已经运用到生命科学中的各个研究领域，比如SNP检测，等位基因检测，基因差异化表达等等。本研究针对RNA-Sequencing中HSP基因在突变体氧化压力中表达量的变化结果，用标准化实时荧光定量反转录PCR的手段加以证明其正确性。论文网

1 材料与方法

1。1  实验材料

野生型斑马鱼从商业化提供者手中购买，或从其他实验室鉴定过基因型的鱼种库中获取。鱼在一个专用的设备中饲养。斑马鱼设备被维持在一天14小时的有光环境，温度为26-27摄氏度。成鱼被喂养在27。5升的有循环水的架子系统的鱼缸中。雌雄比为2:1。成鱼。成鱼饲料为干鱼饲料或者丰年虾。成年雄雌鱼被分开一周以便于交配。收胚胎需要4雄3雌。

生工 UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒；Takara反转录试剂盒；1725201-伯乐（Bio-Rad SYBR green  172-5200）

1。2  实验方法 

1。1。1野生型和突变体的胚胎获取

取适龄DAT-GFP，LRRK2的成对雌雄鱼，多轮交配后用专用孵化液孵化鱼苗。每批次实验取发育进程基本一致的鱼苗即在卵孵化10小时后按发育进程标准排除残次品，按实验进行有氧化压力与无氧化压力的分组。期间不间断进行换水，保证斑马鱼的正常发育，同时进行氧化压力处理。使斑马鱼发育直到3乘24小时后进行实验，而7天的野生型斑马鱼在1。25mM双氧水处理下一般出现大量死亡，故而不适合实验使用。

1。2。2 RNA提取与质量分析

10个发育阶段用来选择斑马鱼的发育时期研究：球状期（4hpf），胚环（5。7hpf），75%外包（8hpf），芽（尾，头）（10hpf），3体节（11hpf），6体节（12hpf），10体节（14hpf），18体节（18hpf），prim-16（31hpf），突嘴（72hpf）。斑马鱼胚胎来源于单个受精卵，20个斑马鱼胚胎放在一起可以用于特定发育时间点的RNA提取。斑马鱼的组织成分组来自于萃取成鱼眼，心脏，肝，肠，肌肉，皮肤，卵巢的RNA。时间进程和组织组成研究重复进行研究。斑马鱼胚胎或解剖的斑马鱼组织在液氮中快速冷冻，之后通过彻底的1mL Trizol试剂，同时使用最大转速的匀浆器搅拌匀浆。250uL氯仿，加入后涡旋15秒，室温保存3分钟，之后12000g离心5分钟，上清液包含RNA，小心转移到新管中同时不能触碰到上下相的分界面。之后加70%的乙醇沉淀RNA，之后加载到旋转离心柱中纯化。