1。 匀浆处理:a。组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。 

b。单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3。5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 

c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。 

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。 

5。 每使用1ml TRIzol加入0。2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 文献综述

6。 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。 

7。 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0。5ml异丙醇，室温放置10分钟。 

8。 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 

9。 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。 

10。室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0。5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。 

RNA质量分析 

初步的质量监控检查是在NanoDrop 分光光度计进行核酸定量的时候，260吸收峰外的读数值可指示污染情况。260/280的比率应该在1。8 至2。1的范围内。同样非常关键的，是要保证实验所用的RNA质量（全长、完整性）不打折扣，因此，我们通常利用Agilent 2100 Bioanalyzer检查RNA的完整性，并根据rRNA峰值的完整性判断RNA样本的情况，选择下一步实验适合的方法。假如有证据显示重要样品有降解，我们会同时检测一个在该样品中已知稳定的管家基因，来观察是否出现由于转录产物不完整而导致管家基因在这个样本中的表达改变。当探针并非处于外显子— 外显子边界时，我们会同时选择中/高表达的管家基因作(-)RT对照，以检查基因组DNA的污染情况。样品可在37oC下孵育2-4小时，并重新在 Bioanalyze上分析降解情况，以检查核酸酶的活性。 来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

RNA浓度用NanoDrop ND-1000光谱仪来测浓度；每个RNA样本测试3次取平均值。RNA样本质量用Agilent 2100生化分析仪检测，遵照仪器说明书操作。0对应完全降解RNA和10对应于完整的RNA。对于所有的实时荧光定量反转录PCR而言，只有RNA样本为RIN为至少7。5的才会被使用，大量的主体样本而言RIN值要至少为8。0。这些值保证的实时荧光定量反转录PCR实验的可靠性。

1。2。3 第一链cDNA的合成