2。3。2 条件优化实验

从YPD斜面上挑取保存的原始菌株及突变株，于液体YPD中培养至OD600=30（培养条件为28℃，培养转速为180 rpm），获得种子液。取1 mL种子液接种于50 mL的赤藓醇发酵培养基中，进行不同的研究。

发酵培养基优化：当研究碳源对赤藓醇发酵的影响时，等量的不同碳源（见表3）分别取代葡萄糖添加到赤藓醇发酵培养基中；当探索有机氮源对赤藓醇生产的影响时，相同浓度的有机氮源如蛋白胨、牛肉膏、玉米浆等分别替带酵母提取物添加至赤藓醇发酵培养基；在葡萄糖浓度优化实验中，不同浓度（150~300 g/L）的葡萄糖分别添加至赤藓醇发酵培养基。在渗透压优化实验中，不同浓度（0~60 g/L）的氯化钠分别加入赤藓醇发酵培养基中；在微量元素的优化实验中，不同浓度的Cu2+（2~8 mg/L）和Mn2+（5~20 mg/L）分别加入至赤藓醇发酵培养基中。

发酵条件优化：在发酵pH优化实验中，发酵培养分别在pH 2~6的发酵培养基中进行；温度优化实验中，发酵分别在26~32℃中进行；在转速优化实验中，发酵分别在160~240 rpm下进行。

以上所有实验中，我们分别在间隔一定的时间及发酵结束时取样测定，所有的实验进行三个平行，实验结果取平均值。

2。3。3 发酵罐扩大培养

为了对实验进行扩大，我们在5L的发酵罐中进行赤藓醇发酵的扩大培养。发酵罐装有碱液泵、氧传感器、搅拌器、加热元件和温度传感器。种子液的制备如上所述。60 mL的种子液（OD600 = 30）被转移到3 L的发酵培养基中。发酵过程中，搅拌器搅拌速度为250 rpm，通气量为3。0 L/min/ L培养基和发酵温度为28℃。发酵过程中，培养基中的DO值保持在20%~30%的饱和度之间。为了避免高剪切力，搅拌速度被限制在250 rpm，通过增加培养基的曝气速率使得DOC被保持>40%以上。在分批培养中，葡萄糖初始浓度为200 g/L，发酵开始后，每隔12 h向培养基中添加一次葡萄糖，使其浓度维持在150 g/L以上，直制赤藓醇产量开始下降。发酵过程中，每隔24 h取20 mL的培养液进行测定。

2。3。4 产物分析方法

摇瓶及发酵罐中的样品采用相同的测定方法。首先将样品离心（3063×g，10 min）。上清液进行发酵产物测定，菌体并用蒸馏水洗涤2次，以除去培养基成分。洗过的细胞离心后获得的细胞丸球，在真空干燥至恒重，以此计算每升培养基中的细胞干重[24]。所得上清液过滤，按1:9的稀释比例用去离子水进行稀释。上清液中的葡萄糖、赤藓醇和甘露醇用高效液相色谱法进行测定（Agilent 1200 Infinity系列，USA），所用色谱柱为Aminex HPX-87H离子排斥柱（300 mm×7。8mm）；流动相为用无菌去离子水稀释的5 mmol H2SO4溶液，用0。22 μm微滤膜过滤后使用。柱子采用35°C的流动相洗脱，流速为0。6 mL/min，进样量为10 μL，赤藓醇、甘露醇和葡萄糖采用示差折射检测器（RID）进行检测。所有实验均进行三次取平均值。来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

3 结果与讨论

3。1 高产赤藓醇突变株的筛选

据报道，高致死率可以保证获得更多具生理变化的突变体[26]，因此50 μL的培养液（稀释至1×106细胞/mL）采用ARTP处理2 min，使Y。 lipolytica SWJ-1b的致死率高达97%。尽管致死率较高，仍有约1×103细胞/mL存活下来，这些存活的菌株被保存并进一步筛选。突变株的筛选是基于发酵培养时赤藓醇的发酵产量高低进行的，其中的104株突变菌株的赤藓醇产量较原始菌株提高。在所有的正突变株中，M53的赤藓醇产量最高，为64。8 g/L，因此该菌株被用于进一步的研究中。原始的野生株和M53培养在基本培养基进行赤藓醇发酵培养， 发酵120 h后，培养基中的葡萄糖被耗尽，发酵结束并进行取样测定。原始菌株和M53赤藓醇发酵的特征比较如表1中所示。在表1中，突变株M53的赤藓醇发酵产量明显增强，细胞浓度略有下降。与野生株相比，M53的赤藓醇产量提高了42。3%，而生物量及副产品产量（甘露醇、阿拉伯醇、柠檬酸、α-酮戊二酸）均有所降低。此外，M53对底物的吸收率高于野生菌株，这进一步促进了M53中赤藓醇合成。