3。7 重组子的酶切 13

3。8  重组子的序列测定 14

结论 17

参考文献 18

致谢 19

1。 前言

1。1 研究背景

能源短缺是本世纪面临的一个重大的问题。对于能源的可持续性来说，燃料酒精是一种潜力巨大的生物能源，可减少温室效益，缓解大气污染情况。而利用纤维素生产燃料酒精是一个重要的研究方向。纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生资源，占地球总生物量的40%左右。然而，目前大多数的纤维素未被开发利用，因此研究开发纤维素具有极为诱人的前景[1]。从高效和环保的角度出发，纤维素被彻底降解而不会对环境造成污染的一条有效途径便是利用纤维素酶的水解作用。里氏木霉是一种纤维素酶系齐全且酶活力较高的木霉，里氏木霉中含有11种β-葡萄糖甘酶，但这些对里氏木霉纤维素酶的表达及对酶活的影响尚待研究。里氏木霉能用于纤维素酶生产在于其具备如下条件：1。里氏木霉生产纤维素酶产量要高。而且可以通过物理或化学诱变获取高产菌株；2。里氏木霉容易培养和控制。里氏木霉要求的生长环境粗放，适应性较强，易于控制，便于管理；3。里氏木霉产纤维素酶的稳定性好。在通常的生产条件下，能够稳定的用于生产，不宜退化；4。里氏木霉产生的纤维素酶容易分离纯化[2]。其产生的纤维素酶是胞外酶，发酵完成后，纤维素酶容易与菌体分离纯化得到所需的酶；5。里氏木霉及其代谢物安全无毒，不会影响生产人员和环境，也不会对纤维素酶的生产造成不良影响。

1。2 文献综述

1。2。1 里氏木霉及其纤维素酶

1。2。2 β-葡萄糖苷酶及应用

2。实验方法

2。1实验材料

2。1。1菌种制备

大肠杆菌（Escherichia coli DH5a）菌种：配制LB固体培养基，高压蒸汽灭菌，倒平板。挑取菌种，在培养基上划线。37℃培养24h至长出菌落。

2。1。2 质粒与载体

质粒DNA保存在大肠杆菌体内，二元载体为含有T-DNA的pCAMBIA-1300，Kanr，Hygr。均来源于淮阴师范学院生命科学学院。

2。1。3培养基

LB培养基（固体、液体）：又称普通培养基，含有酵母提取物、胰化蛋白胨和NaCl。

酵母提取物：酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的淡黄色粉末，其中氨基酸含量30%以上，总蛋白50%以上，核苷酸10%以上，广泛用作生物培养基和食品调味品制造原料。酵母提取物为微生物提供碳源、能源、磷酸盐、生长因子、维生素等。

胰蛋白胨：一种优质蛋白胨，是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化，浓缩干燥而成的白色粉末，含有丰富的氮源、氨基酸等。胰蛋白胨主要提供氮源。

NaCl主要提供微生物生长环境(如渗透压)，其次是提供无机盐。

在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或垫以石棉网直接煮沸溶化。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

LB培养基成分如下（每升）：5g的酵母提取物，10g的胰蛋白胨，10g的氯化钠，15g的氯化钠，15g琼脂粉，NaOH调pH至7。0，121℃、20min高压灭菌。