2。2。1。2目的基因（Bgla）的扩增

1。引物的设计

根据Bgla的DNA序列，设计引物为Bgla-Act-F和Bgla-R, Bgla-Act-F的序列为ATTAATCAGTCACAATGCTGCCTCGCCGGATGC。Bgla-R的基因序列为GAGGCAGCAT

TGTGACTGATTAATGTATGAAGCTGATGAAAG，其中划线部分是Bgla的基因，剩余部分为启动子的基因序列。

2。PCR扩增

同上述步骤先用Taq酶验证条件，然后将Taq酶换成Fastpfu酶。25ul体系为：18。3µL的H2O，2。5µL10×(taq)bµffer，1 µL的基因组DNA，2ul的DNAT,0。5µL的Bgla-Act-F，0。5µL的Bgla-Act-R和0。2µL的Fastpfu酶。PCR反应程序为：94℃，2 min预变性后。94℃，30s变性，60℃ ，30s退火，72℃，30s延伸，三步为一个循环，进行30个循环后，72℃延伸3-5 min。重复上述的步骤多次，将所得到的启动子PCR片段跑胶回收。

3。Bgla DNA的回收

在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，置于1。5ml离心管中（离心管重1g，凝胶重0。48g），凝胶体积按1mg=1ml算，加入3倍体积的Buffer DE-A（1440ul）。混合均匀后于75℃加热。在上述试管中加入360ul的Buffer DE-B,混合均匀。然后将试管摇匀，置于55℃至凝胶溶解（注：如果胶溶解后变紫色，说明pH偏碱性，可加入少量 3M醋酸钠（pH5。2），使溶解液变偏黄色，可提高回收效果），吸取上述步骤3中的混合液，转移到DNA制备管，9000r离心1min,弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加500ml Buffer W1,9000r离心30s,弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加700ml Buffer W2, 9000r离心30s,弃滤液。以同样的方法再用700ul Buffer W2洗涤一次，9000r离心1min。将制备管置回2ml离心管中，9000r离心2min。将制备管置于洁净的1。5ml离心管中,在制备膜中央加30ul的TE，室温静置1min,9000r离心1min洗脱DNA。

然后用Nanodrop法测回收DNA浓度。其方法步骤为：打开电脑，选择Nanodrop2000程序软件，待初始化完成后选择“Nuclear acid”，再初始化。在仪器的加样处加入3µL TE Buffer，洗涤。再加入1。5ml TE Buffer合上盖子。点击“Blank”选项校零。用纸轻轻吸干样品孔的TE buffer，再加入1µL待测DNA溶液，盒盖，点击“Measure”电脑即可生成测量结果（绿色框中），观察DNA纯度是否异常。

2。2。1。3 启动子（Pact）与目的基因（Bgla）的连接（Pact-Bgla）

重叠PCR过程中，Pact的引物Bgla-Act-R设计时要比XbaⅠ-F长，Bgla-Act-R设计时要比Bgla-R长，原因是因为Bgla-Act-R引物上要有启动子相关序列，XbaⅠ-F引物具有目的基因相关序列，在XbaⅠ-F和Bgla-R的作用下，由于采用了具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，接着再进行扩增反应，通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼叠起来。

重叠PCR的方法为：将过柱回收的Bgla和Pact的DNA各1。1µL、2。2µL加入PCR体系中，加入Xbal-F、Bgla-R，Fastpuf酶各0。5ul，PCR反应程序为：94℃，2 min预变性后。94℃，20s变性，60℃ ，20s退火，72℃，2。15min延伸，三步为一个循环，进行30个循环后，72℃延伸5 min。重复多次，将产物进行凝胶电泳，然后进行切胶回收。

2。2。2  Pact-Bgla与载体（pCAMBIA-1300）连接（Pact-Bgla -pCAMBIA -1300）

2。2。2。1 Pact-Bgla的酶切

Pact-Bgla两端含有XbaI和 HindⅢ酶切位点，大肠杆菌pCAMBIA-1300也有这两种酶切位点，并且这两种酶在其它基因克隆中也可以用到，因此综合分析后选择了XbaI和HindⅢ。用XbaI和HindⅢ这两种酶，将目的基因（包含启动子）切出粘性末端，以便于与载体连接。根据说明书配置体系，体系体积根据酶切DNA的量决定。双酶切的Buffer选择根据说明书选择适合两种酶的Buffer，最后选择Ligare buffer。酶切体系（20µL）：2。5 µL的H2O、2 µL的10×Tango buffer，12µL的Pact-Bgla，0。5µL的XbaI，0。5µL 的HindⅢ。