2。1。4琼脂糖凝胶的配制

首先称量：称取琼脂糖0。5g置于锥形瓶中，量取50ml 1×TAE。其次熔胶：将所称量的琼脂粉与TBE在锥形瓶中混合，在微波炉内反复加热2-3次至琼脂糖熔化并无沉淀。再次倒胶：干净的胶槽内摆好梳子，使胶盒处于水平状态，轻轻将琼脂糖溶液倒入胶板内。最后拔梳：待大约20min后，垂直向上轻轻拔掉梳子。

2。1。5主要试剂及实验器材

PCR引物由赛百盛基因技术有限公司合成，XbaI、HindⅢ、T4 DNA Ligase、Taq DNA Polymerase、Fastpfu酶、各种DNA Marker、RNase酶、Fastpfu酶均由宝生物工程(大连)有限公司（TaKaRa）生产，exDNA导纳凝胶回收试剂盒由淮安百慧公司生产，dNTPs北京佳兰生物科技有限公司生产，分子生物学试剂由TaKaRa及北京索莱宝科技有限公司生产，DYY-6C型电泳仪由北京六一仪器厂生产，HZQ-F160全温振荡培养箱由哈尔滨市东联电子技术科技开发有限公司生产，DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱由上海一恒科技有限公司生产，WH-3漩涡混合仪由上海泸西分析仪器厂有限公司生产。

2。2实验方法

本实验首先将β-葡萄糖苷酶Bgla从里氏木霉QM9414提取出来，以里氏木霉基因组DNA为模板，用特异性引物，分别对启动子和β-葡萄糖苷酶Bgla进行扩增，然后将β-葡萄糖苷酶Bgla的基因序列通过重叠PCR的作用连接在看家基因（β-actin）的启动子后面，由于两者的基因具有重叠序列，通过酶的作用可将其第一个密码子连接在β-actin的启动子后第一个的密码子位置上。并将其克隆到二元载体pCAMBIA-1300 中，这样各β-葡萄糖苷酶的表达将受β-actin的启动子的控制。最后经过测序检测后导入受体细胞中，进行低温保存。克隆步骤如图1所示。

图1  β-葡萄糖苷酶Bgla的克隆步骤

2。2。1 启动子（Pact）与目的基因(Bgla)的扩增

2。2。1。1 启动子（Pact）的扩增

1。引物的设计

根据Pact的DNA片段序列，设计引物为Bgla-Act-R和XbaⅠ, XbaⅠ的引物序列是TATATATATCTAGACACAGCAGAAGGGGGTTCCGTCAAC，其中双下划线标记基因是限制性内切酶XbaⅠ的识别位点。Bgla-Act-R的引物序列是GAGGCAGCATTGTGACTGATTAAT论文网

GTATGAAGCTGATGATGAAAG。其中下划线标记基因是Bgla的基因，其余部分为Pact的DNA序列。 

2。PCR扩增

由于Taq酶不具有3'→5'的外切酶活性，易导致扩增过程中碱基的错配，从而引起基因突变，影响基因的功能，因此先用Taq酶验证条件，然后将Taq酶换成Fastpfu酶。25ul体系为：17。3µL的H2O，2。5µL10×(taq)bµffer，1 µL的基因组DNA，3ul的DNAT,0。5µL的Bgla-Act-F，0。5µL的Bgla-Act-R和0。2µL的Fastpfu酶。PCR反应程序为：94℃，2 min预变性后。94℃，20s变性，60℃ ，20s退火，72℃，40s延伸，三步为一个循环，进行30个循环后，72℃延伸5 min。重复上述的步骤多次，将所得到的启动子PCR片段跑胶回收。

3。启动子DNA的回收

在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，置于1。5ml离心管中（离心管重1g，凝胶重0。17g），凝胶体积按1mg=1ml算，加入3倍体积的Buffer DE-A（510ul），混合均匀后于75℃加热。在上述试管中加入255ul的Buffer DE-B,混合均匀。然后将试管摇匀，置于55℃至凝胶溶解（注：如果胶溶解后变紫色，说明pH偏碱性，可加入少量 3M醋酸钠（pH5。2），使溶解液变偏黄色，可提高回收效果），吸取上述步骤3中的混合液，转移到DNA制备管，9000r离心1min,弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加500ml Buffer W1,9000r离心30s,弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加700ml Buffer W2, 9000r离心30s,弃滤液。以同样的方法再用700ul Buffer W2洗涤一次，9000r离心1min。将制备管置回2ml离心管中，9000r离心2min。将制备管置于洁净的1。5ml离心管中,在制备膜中央加15ul的TE，室温静置1min,9000r离心1min洗脱DNA。