SBD是淀粉降解酶中的一个功能性结构域，能促进酶与不溶性淀粉粒结合，从而增加酶在淀粉粒表面的浓度[1]。另一个作用是破坏淀粉粒表面的结构从而提高淀粉分解速率[2]。SBD通常是较小的结构域，其结构在不同的酶之间以及不同的生物之间是非常保守的。在已经发现的69个CBM家族中，具有生淀粉结合能力的家族有11个，即CBM20，CBM21，CBM25，CBM26，CBM34，CBM41，CBM45，CBM48，CBM53 ，CBM58和CBM69[3]。到目前为止，CBM20是研究最为透彻的家族。晶体学研究表明，大多数CBM20s具有两个独立的淀粉结合位点[4]，每一个结合位点都具有两个或三个裸露的芳香族氨基酸，这些氨基酸在淀粉结合中起着非常重要的作用[5] 。最近的一些研究表明，即使与蛋白的其它结构域分离SBD仍然具有与不溶性淀粉粒的亲和性。有人将不能与生淀粉粒结合的酶与SBD融合后就具有与生淀粉粒结合的能力[6，7]。

    在一些淀粉降解酶中含有以串联重复形式排列的两个或多个SBD。例如，在芽孢杆菌α-淀粉酶中含有两个串联重复的SBD，在Clostridium acetobutylicum ATCC 824 的α-淀粉酶中也有两个串联重复的SBD；在嗜碱性革兰氏阳性细菌的淀粉酶中发现有三个串联重复的SBD；在Lactobacillus manihotivorans的α-淀粉酶中发现有四个串联重复的SBD[8]，在Lactobacillus amylovorus的α-淀粉酶中发现有五个串联重复的SBD。

    一般认为，天然淀粉酶中的多个串联重复的SBD具有更高的淀粉亲和力。例如，Bacillus halodurans麦芽己糖形成酶的两个串联重复SBD与不溶性淀粉粒的亲和力比单个SBD的亲和力大约提高了50倍，而这种淀粉亲和力的增加主要归因于淀粉酶中的两个串联SBD在结合淀粉时具有协同效应[9]。在Lactobacillus amylovorus的SBD中也发现有协同效应。与单个的SBD相比，多个串联重复的SBD能显著增加与不溶性淀粉的亲和力[10]。在一些天然纤维素酶和木聚糖酶中也有类似的报道[11] 。

    黑曲霉糖化酶SBD属于CBM20家族成员。尽管目前对黑曲霉糖化酶SBD (GASBD)的结构和功能进行大量研究，但人工构建的多个串联重复的GASBD在结合淀粉时是否具有协同效应还没有报道。在本研究中，通过对GASBD(s)蛋白与不溶性淀粉之间的亲和力进行定性和定量分析，从而确定串联重复的GASBDs蛋白在结合淀粉时是否具有协同效应。

2  实验材料

2。1  菌株与质粒

    含有质粒pET28a-GASBD(s)的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

2。2  仪器 

    台式冷冻恒温振荡箱，电磁炉，分光光度计，高压蒸汽灭菌锅，垂直板电泳槽及配套的玻璃板，电热恒温鼓风干燥箱，磁力加热搅拌器，pH计，超净工作台，恒温恒压电泳仪，脱色摇床，电子天平，通风柜，凝胶成像仪等。论文网

2。3  试剂

    1M IPTG、50μg/ml Kana、20mM Tris-HCL(pH8。0)、10%(W/V)过硫酸铵、结合缓冲液、5×Tris-Glycine buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)、100mM NaAc缓冲液(pH 6。0)、洗脱缓冲液、5×SDS-PAGE loading buffer、考马斯亮蓝R-250染色液、考马斯亮蓝染色脱色液、20mM咪唑、300mM咪唑、20%乙醇(树脂保存液)、5×Tris-Glycine buffer(NADE电泳缓冲液)、5×NDAE loading buffer Ni2+-NTA购自于Novagen公司，IPTG、Kana、溶菌酶、考马斯亮蓝R-250、聚丙烯酰胺、过硫酸铵、咪唑购自于南京天为公司、玉米淀粉购自于Sigma公司。

2。4  培养基

    LB培养基(Luria–Bertani培养基)、TB培养基(Tartoff-Hobbs Broth/Terrific Broth，1987)的配制参考《分子生物学实验指南》(第2版)。

3  实验方法