原大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞购买于美国典型培养物保藏中心(ATCC)；

RPMI-1640 培养基、马血清、胎牛血清购于Gibco公司；

二甲基亚砜、台盼蓝、甲氮甲唑蓝(MTT)及台酚蓝购自Sigma公司；

超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒（Ann Arbor, MI）、过氧化氢酶(CAT)试剂盒(碧云天)、蛋白质羰基含量测定试剂盒(Sigma–Aldrich) 均购于碧云天生物研究所；

过氧化氢（质量分数30%）为国药集团化学试剂有限公司提供。

2。2 实验仪器

CO2培养箱日本SANYO公司;

Infinite M200 Pro型酶标仪瑞士Tecan公司;

超速冷冻离心机Eppendorf公司;

净化工作台; 

倒置显微镜及照相系统等。

2。3 荷叶总黄酮提取及含量的测定[11]

2。3。1 荷叶总黄酮提取

采摘新鲜荷叶室温阴干、粉碎后, 称取200g荷叶粉末，按料液比1：30，加入75% ( V/ V) 乙醇水溶液热回流提取，提取温度为60℃，每次浸提2 h 共3次, 提取液过滤后减压浓缩定容至50 ml, 此为荷叶总黄酮供试液。

2。3。2 芦丁标准曲线的制作[11]

用乙醇配制不同浓度的芦丁标准溶液（0、0。1、0。2、0。3、0。4、0。5 mg/mL），各吸取1 mL后加入5%亚硝酸钠0。3 mL，摇匀，避光反应5 min，依次加入10%硝酸铝0。3 mL，4%氢氧化钠2 mL，混匀放置15 min后，在波长510 nm处测定其吸光值。以芦丁浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制芦丁标准曲线。

2。3。3荷叶总黄酮含量的测定

取供试液1 mL，按照标准曲线的测定方法，在510 nm处测定吸光度。根据回归方程计算荷叶中总黄酮提取率：

式中，C—总黄酮质量浓度，mg/mL；V—提取液体积，mL；N—稀释倍数；M—莲蓬壳质量，g。

2。4 PC12 细胞培养

用含5%胎牛血清、10%马血清、100 U/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素的RPMI 1640培养液，37℃、5% CO2条件下培养细胞，观察细胞生长状态，每3 d传代1次。待细胞生长至融合率达80%时，用0。25%胰酶消化细胞，调整适当的细胞密度接种于细胞培养板进行各项指标测定。

2。5 荷叶总黄酮单独给药对正常 PC12细胞的影响

取对数生长期细胞，计数后调整细胞数至5×104个接种于96孔板，培养16 h。加入不同浓度的荷叶总黄酮样品0, 20, 40, 80g/mL组，每组设3个复孔。处理6h后，吸去上清，每个孔加入20 µL的MTT工作液，于二氧化碳培养箱内培养4 h，加入100 µL MTT终止液，完全溶解后，使用酶标仪于550 nm处测定吸光度，计算细胞生长率。

2。6 荷叶总黄酮对 PC12细胞凋亡率的影响

取对数生长期细胞，计数后调整细胞数至5×104个接种于96孔板，培养16 h。分别设正常组（不加药物正常培养的细胞），荷叶总黄酮样品0。5, 1, 2, 4 mg/mL组，同时设无细胞的空白对照组，每组设3个复孔。细胞接种0。5 h后，加入H2O2 0。5 moL/mL。处理6h后，吸去上清，每个孔加入20 µL的MTT工作液，于二氧化碳培养箱内培养4 h，加入100 µL MTT终止液，完全溶解后，使用酶标仪于550 nm处测定吸光度，计算细胞生长率。文献综述

2。7 荷叶总黄酮对氧化应激的PC12细胞中SOD、Cat活力以及MDA、蛋白质羰基含量的影响

取对数生长期PC12细胞，计数后每孔接种6×105个细胞于6孔板，培养16 h后，加入不同浓度的样品溶液，0。5 h后，加入H2O2处理6 h，吸去上清，完成给药及H2O2处理后，采用细胞刮彻底收集细胞，用预冷的PBS洗涤，超声破碎细胞，4℃下8000 r/min 离心15 min，收集上清液按照试剂盒方法测定细胞匀浆中SOD、Cat活力及MDA、蛋白质羰基含量。