在纤维素降解的过程中可以看出,β-葡萄糖苷酶是纤维二糖被催化成葡萄糖的唯一途径,所以在降解纤维素的时候存在着举足轻重的地位。β-葡萄糖苷酶的酶活对于纤维素被分解的程度有很大影响。当酶的活性增强的时候,降解的速度将会不断上升,直至到达一个恒定值,当减少该酶的酶活时,发现降解的程度也会变低。
β-葡萄糖苷酶在糖苷水解酶家族的第一和第三家族中。其中经过研究第三家族中的cel3a这个基因,发现如果缺少或减少这个基因,β-葡萄糖苷酶的催化能力就会降低,而当这个基因过表达的时候,就会发现酶活有所加强,催化能力不断上升。从以上实验可得出,cel3a这个基因对β-葡萄糖苷酶的催化能力有影响。
丝状真菌中发现其中能大量合成并且分泌纤维素酶,其中最具代表的就是里氏木霉。在诱导的条件下,分泌的蛋白可达每升一百克左右[1]。本实验将本组筛选出的具有较好降解纤维素活性的丝状真菌NF7-2作为受体进行转化。且该丝状真菌,产量高,孢子多,不易被其他菌感染,大大增加了转化的成功率,所以决定选用丝状真菌NF7-2作为转化的受体。
文献中报道较多的是通过原生质体转移法[2]进行转化,该方法较经典,但是因为原生质体的制备和再生费力费时,而且效率不佳。近几年发现了更为简单的农杆菌介导的转化方法(ATMT法),其转化率比较高、良好的重复性,在众多的转化系统方法中脱颖而出。自从农杆菌被发现之后,不断被用于果园种植,苗圃生产,并且还被多次运用到转基因上,用于改良品种。所以农杆菌渐渐受到科学家和农业工作者的关注。由于人们不断更新载体系统,使得农杆菌介导转化法更加完善。如今很多利用农杆菌介导实验成功,越来越多的工作者表示对该介导转化法很有兴趣,希望开拓该法的利用面。
70 年代后,研究者们用转座子等方法对 T-DNA 作遗传分析,并对 T-mRNA以及其翻译的蛋白质作生化分析,初步揭示了农杆菌感染的机制。受伤过的一些植物部分很快就会被农杆菌感染,通过对这些部分进行测序,观察到其中居然有Ti质粒。由此发展出了一种新的转化方法----农杆菌介导转化。除了对植物进行之外,农杆菌转化还可以对酵母,丝状真菌,动物细胞等物质都能进行转化。相较于传统丝状真菌转化方法需要原生质体的制备,ATMT法可以对丝状真菌的孢子,菌丝等直接当做受体,进行转化,这样操作简单方便,转化率又大大提升。所以在对丝状真菌转化的时候多采用该法应,据统计,该转化方法成功转化丝状真菌六十余中[3]。
农杆菌介导系统DNA直接的方法存在很大的差异,这是一种生物转化系统,因此有农杆菌介导能够独立自主地进行:它有能力在T-DNA的两个末端可选择性地移动Ti质粒,当有virD2存在的时候,它可以积极地进入到植物上的染色体,而在直接法中,被整合到染色体上的DNA往往没有选择性,被动地。并且,通过农杆菌转化系统这一个新兴的转化方法,所获得的转基因植株还具有很多优点,比如基因拷贝低、转基因大都被表达,以及可转移基因片段相较之前比变大等一些优点。文献综述
Ti质粒介导T-DNA的转移的过程如下。
(1)经过乙酰丁香酮的激活,信号被传达。在植物中,受伤细胞会分泌类似乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)的诱导剂,农杆菌就是通过感应这类创伤诱导分子从而激活介导转化的功能[9]。编码受体蛋白,在一个可接受的环境信号分子VirA编码感受蛋白,可接受环境中的信号分子。激活VirA蛋白,VirG基因就能获得表达[10]。经激活的Ⅵ硒蛋白与其他vir系列基因DNA结合并激活操纵子[11]。农杆菌染色体上的ChvE蛋白诱导vir基因被激活。