(2)在Ti质粒上加工T-DNA区。(VirDl,VirD2)，VirDl(解旋酶)和VirD2(内切酶)相结合，前者可使DNA从超螺旋型转变为松弛型状态；后者可以减少蛋白的松弛状态中的T-DNA，左、右边界的25 bp重复序列产生的缺口[13]。VirD2蛋白结合到单链DNA(T-链)5’端结合，并且离开细菌进入真菌细胞核内[14]。另外，右侧边界反复序列一旦不见，T-DNA不能转移，而左侧界序列的缺失会逐渐使T-DNA转移率下降[15]，这是因为有一个位置靠近右边界转移增强子[16]。

(3)关于T-DNA和Vir蛋白的分泌(virB operon、virD4)．

农杆菌VirB操纵子大多数与Vir蛋白有关，行使其运输的功能[17]。直至今日，有五个蛋白与该分泌机制有关：VirD2，VkD5，VirE2，VirE3N ，VirF[18]。其中，蛋白与核酸共同作用，形成蛋白复合物，指导分测[19]。

(4)T-DNA运输、核定位及其整合(VirD2，VirD5，VirE2，VirE3，VirF)．

VkD2 and VirE2可能与细胞核内定位有关[20,21]。此外，VirE2蛋白整合到单链T-DNA。T-DNA可形成细长的核酸蛋白复合物（T -复杂体），形成一个便于运输的形态[22]。VirF则在T-DNA整合前从VirD2．VirE2．T链复合物上剥离蛋白[23]。该过程是一个随机的过程。

由于农杆菌介导的系统有很多优点，虽然DNA直接转化法已经成功在单子叶植物中进行报道，但是，人们仍然不断探索开发与创新对农杆菌转化系统，不断与时俱进，希望有机会成功地运用到植物，丝状真菌，细菌等许多物质，并且在研究转化这取得了不断的拓展与创新。

在本此实验中，农杆菌介导的丝状真菌NF7-2引导转型。转基因菌株能够稳定遗传，并对一些能影响转化效率的条件加以改善，得到更多成功转化的孢子，将孢子进行稳定遗传。为下一步，把成功转化后的转化子再次转进丝状真菌奠定基础。来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-

1 材料与试剂

1。1 丝状真菌NF 7-2 

丝状真菌表达体系具有原核细胞和酵母细胞表达所不具备的优势。丝状真菌蛋白质分泌能力很强，生产分泌蛋白的能力比细菌更胜一筹。丝状真菌NF7-2与丝状真菌中最为代表的里氏木霉的活性相当。所以选取NF7-2的β-葡萄糖苷酶cel3a的基因当做受体。由于丝状真菌NF7-2产量高，孢子数多，而且农杆菌ATMT法转化效率高，可以直接把丝状真菌的菌丝或孢子当做受体直接转化，操作简便，效率也高。