1。3  萜类化合物生物合成途径

榄香烯作为一个倍半萜化合物，其合成途径同其他倍半萜类化合物，共有两条途径，分别为甲羟戊酸途径（MVA 途径）和5-磷酸脱氧木酮糖/2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径（DOXP/MEP途径）[5]。这两个途径大体上可分为3个阶段，即中间体异戊烯基焦磷酸（IPP）及其双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸的生成（DMAPP）、直接前体物质的生成和萜类生成及其修饰阶段[5]。本实验中所研究的内容主要是借鉴了该生物合成途径的下游部分，萜类生成阶段。主要是从萜类合成酶的基因出发，以期催化萜类合成酶与底物法呢基焦磷酸（FPP）的反应，然后通过环化、耦联、分子重排产生倍半萜化合物—榄香烯。论文网

1。4  吉马烯A合酶的概述

吉马烯A合酶是合成榄香烯生物途径中的关键酶，具有环化的作用，能够催化法尼基焦磷酸（FPP）生成功能结构及活性多样的倍半萜化合物，同时在催化过程中，其机制的多样性将对所生成的榄香烯结构的丰富性具有重要的影响。而β-榄香烯前体吉马烯A是由吉马烯A合酶催化生成，因此对温郁金中吉马烯A合酶研究具有重要意义。

1。5  本研究目的及其意义

β-榄香烯具有低毒、广谱的抗肿瘤活性，但是从植物分离提取这种物质不仅要求高、投料多，而且得到的产物产率低、耗时长、纯度低。另外，化学合成β-榄香烯步骤繁琐、要求条件严苛难以实现工业应用。因此，本研究通过使用实验组构建好的温郁金GCS-大肠杆菌DE3菌株，运用定点突变技术对关键氨基酸位点进行突变。再利用传统的突变-筛选方法获取酶活力较高、副产物最少的温郁金吉马烯A合酶突变体。本研究将致力于提高β-榄香烯的产品质量、降低其生产成本、提高生产效率，为β-榄香烯的工业化生物合成提供技术前提。本研究成果将有利于该药物在普通癌症患者中使用，并且将为我国的自主知识产权的抗肿瘤药物产业做出贡献。

1。6  本研究的技术路线

1）根据烟草TEAS晶体结构模拟温郁金GCS三维结构

2）采用定点突变技术对关键氨基酸位点进行突变

3）用GC-MS检测突变蛋白催化性质，筛选获得催化效率较高、目的产物产量较高、副产物最少的突变体。

2   吉马烯A合酶基因的突变及转化

该阶段主要是利用课题组已获得的温郁金GAS-大肠杆菌BL21（DE3）菌株，通过突变PCR进行突变，将突变后的PCR产物转化至Trans-Bule感受态细胞中，再通过提质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞中。

2。1  实验材料

2。1。1  实验试剂

试剂盒：质粒DNA小量提取试剂盒(英国Favorgen)。

分子试剂：2 × Hieff™ PCR Plus Master Mix、（上海翊圣生物科技有限公司）、琼脂糖（上海鼎国生物科技有限公司）、TAE缓冲液（上海鼎国生物科技有限公司）、DNA marker 2000 plus（美国Trans-tech）、6×Loading buffer（北京全式金生物技术有限公司）、KOD酶(TOYOBO)、2×KOD buffer（英国OXOID）、2mM dNTPS(TOYOBO)、DpnI酶(TOYOBO)、15K DNA Maker（美国Trans-tech）、蛋白胨和酵母提取物（英国OXOID）蒸馏水（实验室自制）。

自配试剂：四环素 (Tet, 100 mg/mL)、卡那霉素 (Kan, 50 mg/mL)。

2。1。2  实验仪器 

EDC-810基因扩增仪（东胜创新生物科技有限公司）、DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、BS224S电子天平（德国Sartorius）、微量移液器（美国Thermo Scientific）、9426A恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司）。