AHL分子荧光法检测质粒的构建
时间:2016-12-18 19:44 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
| 摘要：群体感应是细菌生长到一定密度时相互感应，并进行基因表达及调控产生的独特、多样的群体行为现象。N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones，AHL）类化合物是革兰阴性菌群体感应中最重要的一类信号分子，调控许多生理特性基因的表达。快速、简便、有效地检测细菌能否产生AHL或产生何种信号分子，成为深入研究和了解细菌群体感应的重要手段。本论文试图构建一个含有绿色荧光蛋白基因的生物传感器，通过该生物传感器在含AHL的培养液中的荧光产生情况来检测环境中的AHL是否达到值域。试验方法主要使用pLuxGFPuv2和pLuxR两种质粒通过PCR扩增，酶切和拼接等操作构建含有GFP基因的检测质粒并转化宿主，观察biosensor在含AHL的培养基中的产荧光情况。4509 关键词： 群体感应；AHL信号分子；生物传感器；检测Construction of a plasmid for detecting Acyl-homoserine lactones Abstract: Quorum sensing is the unique,diverse group behavior phenomenon occurred when the bacterium grows to a certain density and responses mutually,and it is responsible for the gene expression and the regulation. Many gram-negative bacteria are known to use acylhomoserine lactones (acyl-HSLs) as intercellular signals, called autoinducers, in density dependent gene expression, autoinducers at high cell densities can achieve critical concentration and activate the expression of specific genes. Rapid, simple and efficient detection of bacteria wether can produce signal molecules AHL or other kinds of signal molecules, become important means of in-depth study and understand of bacterium quorum sensing. Biosensor method was used in this paper attempted to detect whether the signal concentration reaches a threshold level. We chose plasmid pLuxGFPuv2 and plasmid pLuxR, using ways of PCR, enzyme digestion and ligation to construct a novel lasmid which contains GFP. The plasmid was than transformed into a host and the case of the biosensor producing fluorescence can be watched. Key Words: Quorum sensing; Acyl-homoserine lactone; Biosensor; Detection 目 录 1 绪论 1 1.1 细菌的群体感应 1 1.2 N-酰基高丝氨酸内酯 1 1.3 AHL信号分子的检测方法 2 1.4 传感菌检测AHL信号分子国内外研究进展 4 1.5 本研究的主要内容与研究的意义 5 2 实验材料与方法 8 2.1 材料与仪器设备 8 2.1.3 主要仪器和设备 11 2.1.4 主要器皿 12 2.1.5 培养基及试剂的制备 12 2.2 本研究所涉及的技术 12 2.3 实验方法 13 3． 实验结果与讨论 19 3.1 质粒抽提 19 3.2 绿色荧光蛋白GFP的扩增 19 3.3 目的基因与载体质粒的酶切 20 3.3.1 目的基因GFP的酶切 20 3.4 重组质粒的构建和转化 24 3.4.1 重组质粒的拼接 24 3.4.2 转化DH5α和Top10F’感受态细菌 26 3.5 重组质粒的验证和筛选 27 4 结论 29 致谢 30 参考文献 31 1．绪论 1.1 细菌的群体感应 细菌群体感应（quorum sensing，QS），也称自诱导，是细菌根据种群密度大小进行胞内或胞间信息交流，协调群体行为，并调控基因表达的一种机制[2]。 20世纪60年代以来，随着Nealson K H等在海洋细菌费氏弧菌(Photobacterittm fischeri)，曾用名(Vibro fischeri)和夏威夷弧菌(Vibro haveryi)中发现了由群体感应控制的生物发光现象及其深入研究，人们逐渐的认识到细菌之间具备信息交流能力。细菌间的交流并不像人类间的交流通过“声波”，而是依靠某一种或多种信号分子相互交谈，细菌之间可以根据这些信号分子的浓度的高低来感受周围环境中自身或其他细菌的数量变化，并通过信号分子发出信号, 启动菌体中相关基因的表达, 改变和协调它们之间的行为, 共同展示出它们的某些生理特性, 从而表现出单个细菌无法从事的某些生理功能和调节机制。这一调控系统被称为细菌的群体感应调节（quorum sensing，QS）[3,4]。 (责任编辑：qin) |