AHL分子荧光法检测质粒的构建(8)
时间:2016-12-18 19:44 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
dNTP 30 µL 引物1（gfp1031f） 6 µL 引物2（gfp2841r） 6 µL 模板（pLuxGFPuv2） 2 µL Taq DNA 聚合酶 3 µL ddH2O 213 µL ———————————————————————————— Total Volume 300 µL 将上述PCR反应混合物混匀并迅速分装到6个0.5 ml PCR塑料管中，每管50 µL，并标号GFP1~GFP6。由于要处理的管数少，因此将6管反应混合物置于PCR仪中央对称放置，使其受热均匀。 ② PCR循环： 94℃ 5min 1个循环 94℃ 30s 52℃ 45s 30个循环 72℃ 1min 72℃ 7min 延伸 ③ 对PCR产物进行用琼脂糖凝胶电泳验证（见图3-1）。 2.3.4 目的基因与载体质粒的酶切 用AatⅡ限制性内切酶对pLuxR和扩增产物GFP进行酶切，并用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收。由于载体经单一限制性核酸内切酶切割后，载体分子易于自我环化，既不利于目的基因的重组连接，大大降低阳性克隆效率，又可使非重组性载体造成高背景。因此，在AatⅡ酶切完成后，立即用碱性磷酸酶对线性化的pLuxR进行去磷酸化处理，并用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收。酶切后的pLuxR和GFP片段的长度应该分别为3317bp和1050bp。 （1）目的基因GFP的酶切 ① 反应体系： AatⅡ 2μL 10×Buffer Tango 2μL DNA 5μL 无菌水 up to 20μL ② 轻柔地翻转几秒，使反应液混合均匀。 ③ 在37℃下孵育5h。 ④ 在65℃下放置20min使酶失活。 ⑤ 用琼脂糖凝胶电泳验证酶切结果（见图3-3）。 （2）对1050bp处的条带进行割胶回收，并再次电泳验证回收结果。 ① 通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含有需回收DNA的琼脂块，放入1.5mL离心管中。判定DNA片段的位置时，要尽可能使用长波紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短。切胶时应尽可能减少胶的体积。 (责任编辑：qin) |