AHL分子荧光法检测质粒的构建(10)
时间:2016-12-18 19:44 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
DNA 5μL 无菌水 up to 50μL ② 在37℃下孵育1h。 ③ 在65℃下放置30min使酶失活。 ④ 用琼脂糖凝胶电泳验证酶切结果（见图3-6）。 ⑤ 割胶回收酶切产物并用琼脂糖凝胶电泳验证回收成功与否（见图3-7）。 2.3.5 重组质粒的构建和转化 用T4 DNA 连接酶对纯化后的GFP和pLuxR载体进行拼接，并用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收重组质粒。用纯化后的重组质粒通过一步法制备高效感受态细胞试剂盒转化DH5α和Top10F’感受态细菌，并在LB平板（含Kan）上涂布培养。 （1）质粒拼接 ① 反应体系： Linear vector DNA 7μL Insert DNA 7μL 10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL T4 DNA Ligase 1μL 无菌水 up to 20μL ② 在22℃下孵育10min。 ③ 在65℃下放置10min使酶失活。 ④ 用琼脂糖凝胶电泳验证拼接结果（见图3-8）。 ⑤ 割胶回收并再次电泳次验证回收结果（见图3-9）。 （2）转化DH5α和Top10F’感受态细菌 ① 用LB液体培养基（无抗性）将DH5α和Top10F’于37℃摇床培育12h进行复苏和扩增。 ② 将菌液涂布于LB平板上（无抗性），标号：DH5α无抗、Top10F’无抗，37℃孵育15小时。 ③ 分别挑取两平板上的菌落于LB液体培养基（无抗性），37℃摇床培养12h，用于转化。 ④ 各取1mL两种菌液于1.5mL EP管中。 ⑤ 4000rpm李新4~5min，彻底去除上清，再加0.1mL预冷的SSCS溶液轻轻悬浮菌体。 ⑥ 加入5µL重组质粒。 ⑦ 混匀DNA和细胞且在冰上放置30min，然后42℃放置90s，再在冰上房子15~20min。 ⑧ 加800µL的LB培养基到离心管中而后在37℃，200rpm下培养1h。 ⑨ 取100µL细胞涂布于相应抗性（同时含有Kan，IPTG、只含Kan）的LB平板上，得到4块平板：重组质粒导入DH5α（Kan，IPTG），重组质粒导入DH5α（Kan），重组质粒导入Top10F’ （Kan，IPTG），重组质粒导入Top10F’ （Kan），于37℃孵育15小时并观察结果（见表3-1）。 2.3.6 重组质粒的验证和筛选 由于重组质粒在拼接时两个片段有一定几率反向连接，因此我们需要筛选出连接方向正确的转化株。我们采用PCR扩增的方法，用引物gfp1031和pD1来验证其方向。引物gfp1031的序列在目的基因上，而引物pD1的序列在靠近引物gfp1031序列一端的载体质粒上，若目的基因的插入方向正确，应无法得到PCR产物，反之则说明目的基因被反向插入。我们用Top10F’的转化株来验证目的基因的插入方向。随机挑取转化株平板（含Kan）平板上的6个菌落至LB液体培养基（含Kan）37℃摇床过夜培养，然后抽提质粒，标号：1~6。以gfp1031和pD1为引物，以1~6号EP管中的质粒为模板，进行PCR扩增，参数与2.3.3相同。随后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察其结果（见图3-11、3-12）。 (责任编辑：qin) |