AHL分子荧光法检测质粒的构建(2)
时间:2016-12-18 19:44 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
不同的细菌在繁殖过程中分泌不同的信号分子来调控基因的表达，这种信号分子利用信号分子在细胞间扩散，来感知自身和周围环境中其他菌群的数量变化，当信号分子浓度达到一定阈值时就启动菌体相关基因表达，调控相关生物学功能[5]。如产生毒素、形成生物膜、产生抗生素、生成孢子、产生荧光等，以适应环境的变化，我们将这一现象称为群体感应调节（quorum sensing，QS）。这一感应现象只有在细菌密度达到一定阈值后才会发生，所以也有人将这一现象称为细胞密度依赖的基因表达（cell density de-pendent control of gene expression）。据已有的研究表明，革兰氏阴性菌通过产生高丝氨酸内酯类 (acyl—homoserine lactonase，AHLs)作为细胞间的信号分子，该信号分子以细胞密度依赖的方式调控生理特性的表达；革兰氏阳性菌利用一些小肽作为QS的信号分子来感知种内自身种群数量，协调多种基因的表达；还有一类信号分子是一种呋喃酰硼酸二酯，即自体诱导子，它在革兰氏阴性菌和阳性菌中均存在，被用来感知种间细菌数量来调控细菌自身行为[6]。 对于革兰氏阴性菌的AHLs类信号分子的特点为：均含有一个高丝氨酸内酯环和4～14个碳不等的酰基侧链，该特征性内酯环结构在质谱鉴定过程中不会破坏。 1.2 N-酰基高丝氨酸内酯 群体感应信号分子N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones，AHL）最初发现于革兰阴性的海洋细菌费氏弧菌（Vibrio fischeri）的生物发光现象：费氏弧菌可与某些海生动物共生，宿主利用其发光捕获食物、躲避敌人及寻觅配偶，而费氏弧菌也获得一个营养丰富的生存环境。很多细菌行为都属于群体感应，如根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）Ti质粒的转化[7]，胡萝卜软腐欧文菌（Erwinia carotovora）[8]、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[9]等毒性基因的表达，致黄假单胞菌（P.aureofaciens）[10]、胡萝卜软腐欧文菌抗生素的产生调控[11]，液化沙雷菌（Serratia liquefaciens）的游动[12]，以及粘质沙雷菌（S．marcescens）的色素产生[13]等。 随着对细菌信号分子研究的不断深入，发现多数细菌都靠分泌AHL进行交流和协调群体行为。AHL是一类特殊的小分子水溶性化合物，可作为QS系统中的自诱导剂。不同细菌产生不同的AHL，但他们都含有相同的高丝氨酸内酯环，主要区别在于酰基侧链的铲断、饱和度及3位碳上的取代基，即N侧链的长度（碳原子数为4~18个，多为偶数，奇数中只有7）或3-碳位置的取代基（氢、羰基、羟基）的不同[14]。 N-酰基-高丝氨酸内酯类（AHLs）化合物是革兰氏阴性菌群体感应系统中最重要的一类信号分子，并调控许多生理特性的表达[15]。但由于AHLs分子为小分子物质，且AHLs产生菌所产生的AHLs的浓度极低，因此建立有效的检测AHLs方法具有非常重要的意义。 1.3 AHL信号分子的检测方法 进入21世纪后，细菌信息交流成为微生物学研究的热门领域，人们希望能针对细菌AHL介导的QS进行干扰和促进，达到有益于人类的目的。目前，检测信号分子AHL的方法通常有3种：①理化手段，主要通过高效液相色谱（HPLC）、气质联用（GC-MS）技术检测纯化来自液体培养基的标本，该方法除能定量外，还能鉴定AHL的性质；②利用传感菌的生物学方法，即群体感应系统控制的色素或荧光如绿色荧光蛋白[16]的产生来检测AHL的存在；③结合物理、化学手段和生物发光的薄层层析。 1.3.1理化方法 ①高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS法)[17] 色谱-质谱法(HPLC-MS 法 )所有信号分子AHL均含一个高丝氨酸内酯环和4~14碳不等的酰基侧链，该特征性内酯环结构在质谱鉴定中不会被破坏，总保持m／zl02的一个特征碎片。AHL的另一个典型特征是其相对分子质量具有172+14n，以14递增的规律。根据AHL的典型特征，以C6-HSL、N-3-OXO-C8-HSL为标准样品建立了IJC-ESI／MS检测方法，可对细菌发酵液中的AHL进行检测。用二氯甲烷、乙酸乙酯或氯仿提取 AHL，残余物用Cts反相半制备柱分离，洗脱液为梯度甲醇或乙腈，部分收集物用生物检测法检出，HPLC检测经过纯化的培养物上清。此法不但可对AHL进行定量还能知道样品性质。 (责任编辑：qin) |