AHL分子荧光法检测质粒的构建(3)
时间:2016-12-18 19:44 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
②气相色谱-质谱法(GC-MS法) 收集稳定期培养物，液液萃取纯化，用选择性离子探测方式(selectedion monitoring，SIM )电子碰撞电离中m／z143的显著片段检测AHL。GC—MS法是检测细菌提取物中AHL的较全面的选择性细菌生物学方法，可评估不同生长阶段 A H L 的产生模式，对检测表达多种独立信号系统细菌培养物的变化很有用，可进一步研究确定其生物合成途径AHL独特的细胞交流功能。此法已用于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、灭鲑气单胞菌(A．salm onicida)、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌 (P．fluo-rescens)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocol．itica)和液化沙雷菌等6种病原菌AHL的检测。 ③液相色谱结合四极线性离子收集器质谱法(LC-QqQLIT法) 利用 A H L 共同离子碎片如高丝氨酸和3-氧代、3-羟基或未被取代的酰基侧链，对上清液AHL进行定量检测。用此法确定假结核耶尔森菌 (Y．pseudotuberculosis)至少产生24种不同的AHL (其中一些是新化合物)，以及AHL各自相应的摩尔比。 ④超高效液相色谱法 (UPLCTM法) UPLCTM法是结合小颗粒和高压LC仪器的新方法。与HPLC相比，为实现高压，要求稳定期颗粒简化时低塔板高度，柱子较低顶点增宽，从而产生较高的选择性和分离敏感性，分散效果较好，但要求传感菌细胞体积尽可能小。此法适合同时快速分析AHL，即使这些化合物几乎没有发色团也可有效分析，但须优化一些参数，如设定梯度、溶剂pH值和流速等，较快峰要求快速探测电子学评价数据。因在质量传递中平的van Deemter曲线，从而使用低的粒径，以增加流动相线速。这些改进可使其用于检测低吸光度溶质，分析时间也会降低到HPLC的5％。也可通过质谱(MS)、核磁共振(NMR)或红外光谱(IR)等光谱特征确定AHL结构，其中MS可检测皮克级样品。与HPLC或GC联用，许多离子法也可用于AHL结构测定，如电子冲击(EI-MS)、快原子轰击(FAB-MS)和化学离子化、正离子气压化学离子化 (APCI-MS)等。红外光谱鉴定分子功能团时很有用，与其他方法合用可精确确定化学结构[18]。 1.3.2 生物学方法 该法主要是利用QS系统控制的色素或荧光产生来检测AHL的存在。因为不同传感菌对不同AHL 的敏感度不同，一种传感菌只能检测酰基侧链在一定范围的AHL，因此构建了多种传感菌，用以检测不同种类、不同结构的AHL。 传感菌的工作原理：主要以大肠杆菌或根癌土壤杆菌为遗传背景的lacZ、或lux等报告融合基因进行构建，或利用紫色杆菌诱导或抑制产生紫色杆菌素性质特性进行检测，紫色杆菌素的产生AHL调节。[19]这些细菌中产生AHL的功能基因被人工剔除或其本身就不能产生AHL，但含有luxR类功能基因和其相应的靶启动子序列以及与其融合在一起的报告基因(如luxAB、lacZ、gfp等)，这些重组细菌就成为AHL的生物感应器，当遇到外源AHL时，报告基因转录表达被启动，通过检测报告基因活性来检测AHL的存在[20]。 ①平板划线法检测AHL[26] 主要用对扩散性信号分子AHL敏感的传感菌来检测AHL的存在和浓度。在 LB固体平板上，检测菌与传感菌平行划线培养，二者不接触但成“T ”字型 ，通过两菌交互点 附近菌体表型可推知AHL的存在及浓度 。用根癌土壤杆菌为传感菌时 ，在LB平板表面涂布适量 X-gal，若被检测菌产生AHL，通过琼脂扩散至报告菌，诱导群体感应系统产生明显颜色变化，在含X-gal平板上产生蓝色；紫色杆菌诱导报告菌群体感应系统产生紫色。平行划线法可初步筛选AHL产生菌。 ②报告平板打孔法 在报告平板孔的AHL向琼脂周围扩散，孔周围报告菌引发群体感应呈现颜色变化，颜色变化区域大小表示AHL含量高低。紫色杆菌对不同浓度C6-AHL的检测结果表明，颜色变化区域直径大小与AHL浓度呈线性相关，因此，利用该法可对产生的AHL进行定量检测。 (责任编辑：qin) |