AHL分子荧光法检测质粒的构建(9)
时间:2016-12-18 19:44 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
② 称量凝胶的重量，以1mg=1µL换算凝胶的体积。 ③ 按照凝胶浓度，按下表提供的参数加入相应比例的Binding Buffer Ⅱ。 凝胶浓度 Binding Buffer Ⅱ ———————————————————————————— 小于或等于1% 4个胶体积 小于或等于1.5% 5个胶体积 小于或等于2% 6个胶体积 大于2% 7个胶体积 ④ 置于50~60℃水浴中10分钟，使胶彻底融化，加热融胶时，每2分钟混匀一次。 （当所需要的DNA片段小于500bp或大于4kp时，需要在不同浓度凝胶的融胶液中加入一个胶体积的100%的异丙醇混匀。） ⑤ 将融化的胶溶液转移到套放在2mL收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟。8,000rpm室温离心1分钟。 （如果融胶吼的总体积大于700µL，可以加样2次以上进行分别离心。） ⑥ 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500µL Wash Solution，8,000rpm室温离心1分钟。 ⑦ 重复步骤6一次。 ⑧ 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12,000rpm室温离心2分钟。 （将离心立新后的UNIQ-10柱放入恒温箱中50℃干燥5分钟，或自然晾干10分钟，有助于酒精的会发，提高DNA的洗脱效率。） ⑨ 将UNIQ-10柱放入一根新的1.5mL离心管中，在柱子膜中央加40µLElution Buffer放置5分钟。 （将Elution Buffer加热到60℃或者直接将Elution Buffer加入到 UNIQ-10柱中后60℃温育5分钟，有助于提高DNA的洗脱效率；也可以用双蒸水，用1M的NaOH将pH值调节到8.5后，再60℃洗脱。） ⑩ 12,000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳验证是否回收到DNA片段（见图3-4）。 （下文中若无特别说明，所提到的割胶回收皆按以上步骤操作。） （3）载体质粒PLuxR的酶切 ① 反应体系： AatⅡ 2μL 10×Buffer Tango 2μL DNA 5μL 无菌水 up to 20μL ② 轻柔地翻转几秒，使反应液混合均匀。 ③ 在37℃下孵育5h。 ④ 在65℃下放置20min使酶失活。 ⑤ 用琼脂糖凝胶电泳验证（见图3-5）。 （4）pLuxR的去磷酸化处理 ① 反应体系： Alkaline Phosphatase 2μL 10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μL (责任编辑：qin) |