2。1。3  酶与试剂盒 5

2。1。4  缓冲液 5

2。1。5  培养基 5

2。1。6  抗生素 5

2。2  实验方法 7

2。2。1  酶切 7

2。2。2  酶连 7

2。2。3  大肠杆菌质粒的提取 7

2。2。4  大肠杆菌基因组的提取 8

2。2。5  基因的凝胶回收 8

2。2。6  感受态细胞的制备 8

2。2。7  固体培养基平板的制作 9

2。2。8  固体胶的制作 9

2。2。9  大肠杆菌质粒的转化实验 10

3  表达载体的构建 11

3。1  方法一 11

3。1。1  引物的设计 11

3。1。2  BtuC，BtuD蛋白基因的扩增 14

3。1。3  目的基因与pTG-19酶连（T连） 15

3。1。4  目的基因的酶切 16

3。1。5  目的基因的回收 16

3。1。6  pET28的酶切 17

3。1。7  目的基因与pET28的酶连 18

3。2  方法二 19

3。2。1  引物的设计 19

3。2。2  BtuC、BtuD蛋白基因的扩增 20

3。2。3  目的基因与pTG19酶连 21

3。2。4  目的基因的酶切与回收 22

3。2。5  酶切质粒pRSFDuet-1 22

3。2。6  BtuC基因与酶切后质粒的酶连 22

3。2。7  酶切pRSFDuet-1+BtuC，与BtuD酶连 23

3。2。8  跑胶验证 24

4  BtuC和BtuD蛋白的表达 25

4。1  预表达 25

4。2  大量表达 25

结  论 26

致  谢 27

参 考 文 献 28

1  绪论

1。1  膜蛋白研究现状

膜蛋白是生物质膜上蛋白质的总称，通常以不同程度嵌入生物膜内（如图1-1）。细胞被膜包围从而形成了疏水性屏障，而膜蛋白，如受体、转运体等则承担起膜内外的信号传递、物质交换等重要使命。膜蛋白调节着细胞的功能，包括能量转换，运输，信号和识别，在分子水平上描述其运作并揭示其机理对于生命过程的理解至关重要。统计数据表明超过50%的现代药物以膜上蛋白为靶点，然而与之形成鲜明对比的是，PDB数据库中已经解析出结构的膜蛋白不到蛋白总量的5%。膜蛋白的研究远远滞后于可溶性蛋白。首先，由于膜蛋白的天然丰度低、体外重组表达困难，再加上其固有的脂溶性，使得用于分析研究的膜蛋白的样品获得十分困难。另外，传统的结构研究手段，如X射线晶体衍射、NMR、电镜等，在膜蛋白分析上显示的弊端，也使得膜蛋白的研究迟迟得不到开展。