1．2  方法

1。 2。 1 酵母交配[12]

(1) 交配：

a) 从-70℃冰箱找出有GFP-Atg8荧光标记的野生型菌株SEY6210(MAT α)和SEY6211(MAT a)，SEY6210 spo14和SEY6211 spo14，SEY6210 atg1和SEY 6211 atg1划线于YPD固体培养基上，30℃，培养3天；

b) 从YPD平板上挑取单菌落克隆于2mL液体YPD中，26℃，50 rpm旋转过夜培养；

c) 分别取10μL SEY6210(MAT α)和SEY6211(MAT a)滴于YPD固体培养基的同一位置，静置于超净台吹干，30℃培养1天。其他两组交配同理。

(2) 筛选二倍体：文献综述

a) 挑取交配位置的菌落在新的YPD固体培养基上划线，并从-70℃冰箱划出交配型测试菌YHY327 (MAT a)和YHY328 (MAT α)及已知的二倍体菌株作为对照，30℃培养3天；

b) 每组交配分别挑取10个单菌落分别接种于2mL液体YPD中，26℃，50rpm旋转过夜培养；

c) 每个样品取50μL加入32孔点样器中，点样于己分别涂布测试菌株的两块YPD固体培养基上（涂布后置于超净台吹干）和一块未涂测试菌的YPD板上，静置于超净台吹干，30℃培养1天；

d) 影印到SD Super固体培养基上，做好对应菌株的标记，30℃培养1天。在涂有两个交配型测试菌的平板上都不生长且在未涂测试菌的平板上生长的是二倍体菌株。

(3) 出芽：

a) 挑取3个确认为二倍体的菌株分别转接于2mL液体YPD中，26℃，50rpm旋转过夜培养；

b) 测吸光值，转接相应体积到5mL液体YPD中，26℃，50rpm旋转培养至对数中期（代时2h）；

c) 取1mL菌液至无菌细菌管中，4000rpm室温离心3min，去尽上清，并用10mL无菌dH2O洗3次，尽量去尽残留的YPD培养基；

d) 加1mL出芽培养基(SPO)和10μL已稀释40倍的氨基酸混合液，涡旋重悬，26℃，50rpm旋转培养2天左右，镜检观察是否有四分体出现。

1．2．2酵母基因组DNA的提取

(1) 从YPD平板上挑取单菌落克隆于2mL液体YPD中，26℃，50rpm旋转过夜培养；

(2) 取1mL菌液于1。5mL EP管中，13200rpm，室温离心1min，去尽上清；

(3) 加入100μL Yeast Lysis buffer，涡旋重悬；

(4) 于通风橱中加入100μL苯酚:氯仿:异戊醇混合液（25:24:1，用前颠倒混匀）；

(5) 加入200μL直径为0。5mm酸洗玻璃珠；

(6) 涡旋，4min；

    (7) 13200rpm，室温离心5min；

    (8) 将上清(80-100μL)转移到新的1。5mL EP管中，加入2。5倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），上下轻轻颠倒至澄清，-20℃ 放置20min；

(9) 13200rpm，室温离心10min；来自~优尔、论文|网www.youerw.com +QQ752018766-

(10) 弃尽上清，加入800μL 70%乙醇（4℃预冷）；

    (11) 13200rpm，室温离心4min，弃尽上清，倒置使残留的液体流出，放入烘箱中吹干；

(12) 加入30μL dH2O，轻弹溶解DNA。