利用冰晶核蛋白构建磷酸盐吸附蛋白大肠杆菌细胞表面展示体系(5)
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
2.2.9酶切、酶连DNA体外重组
通过PCR，获得了phos基因片段，该片段两侧含有加入的2个酶切位点，通过限制性内切酶，将pMD-19T-phos基因定向重组入质粒pMB110中，然后转化表达菌株大肠杆菌JM109，构建出重组菌，重组的phos基因被置于T7启动子下游，其表达受lac操纵子调控。
2.3.0 生长曲线测定
将大肠杆菌JM109接种于5ml LB液体培养基中，重组大肠杆菌JM109接种于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃摇床上过夜培养。然后分别取0.5ml菌液于5ml相应LB液体培养基中，接种9组，接着分别于培养后0，1.5，3，4，6，8，10，12，14取1ml菌液测定OD600 值。实验重复测试3次。
2.3.1绘制磷酸盐标准曲线
（1）准确吸取0，0.5，1，2，3，4 mL磷酸盐标准溶液(1 mL含0.1 mg PO43-)，分别加入到6支50 mL比色管中，用去离子水稀释至10 mL；
（2）向各比色管中准确加入4 mL钼酸钠-硫酸溶液及1 mL 0.15%硫酸肼溶液（w/v），混匀，放入沸水浴中煮沸10 min，取出，立即流水冷却，用去离子水稀释至刻度，混匀；
（3）以试剂空白为对照，在波长660 nm处进行分光光度测定。以吸光度为纵坐标，磷酸盐(以PO43-计)含量(毫克)为横坐标绘制标准曲线。
2.3.2用磷钼酸比色法测定重组菌磷酸盐含量
（1）大肠杆菌待测菌株在50 mL无机磷培养基中，37 ºC震荡培养至对数生长期（OD600=0.6~0.8），IPTG诱导4 h；
（2）以8000 r/min，2 min离心收集菌体，灭菌去离子水洗涤菌体，用含0.5 mg/mL PO43-的磷酸二氢钾溶液调整菌液至OD600为1.0，置于室温摇床上，每隔1 h取1 mL样品，以8000 r/min，2 min离心，取上清；
（3）将1 mL上清液，30 mg亚硫酸钠，4 mL钼酸钠-硫酸溶液和5 mL去离子水加入比色管，沸水浴中煮沸10 ，取出；
（4）向管中加入1 mL 0.15%硫酸肼溶液，混匀后继续煮沸10 min，取出，用流水冷却并用去离子水稀释至刻度，混匀；
（5）以试剂空白为对照，在波长660 nm处测定其吸光度，从标准曲线上查得相应的总无机磷酸盐（以PO43-计）含量（毫克）。
3.实验结果与分析
3.1 phoS基因的克隆和重组质粒的构建
从大肠杆菌中通过PCR方法扩增得到phoS基因，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。其大小与预期相符。
将该基因连接pMD-19T载体，并转化大肠杆菌，获得含phoS基因的转化子，提取质粒电泳结果如图2所示。
图1：，DL2000 DNA Marker, phoS基因PCR扩增结果
图2：pMD19T-phoS质粒电泳图
将pMD19-T-phoS重组质粒上的phoS基因通过酶切、连接替换重组质粒pTrcHisC-(inpN)3-gfp中的gfp基因，构建重组质粒pTrcHisC-(inpN)3-phoS。将该质粒转化大肠杆菌，得到的转化子进一步进行质粒抽提和酶切验证，结果如图3所示，酶切大小与预期相符。
图3：pTrcHisC-3(inpN)-phoS酶切验证图，泳道 M1 DNA分子量Marker，泳道1，Nco I/EcoRI双酶切JM109(pTrcHisC 42736bp;3(inpN)-phoS)；泳道2，BglII/EcoRI双酶切JM109(pTrcHisC-3(inpN) 5800bp;phos 972bp)；泳道3，BglII/Nco I/双酶切JM109(pTrcHisC-phoS 5245bp;3(inpN) 1581bp)。
3.2大肠杆菌重组菌生长曲线测定结果
表2 重组大肠杆菌JM109和大肠杆菌JM109不同培养时间OD600nm 值的差异分析
时间 h 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14
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