番茄突变体Cnr是一种无色非成熟突变体，表现为番茄果实成熟后果皮颜色仍是白色或者无色来自优Y尔L论W文Q网wWw.YouERw.com 加QQ7520~18766 ，表明Cnr位点编码的基因在番茄果实成熟中发挥重要作用。通过定点克隆技术或遗传图谱的分析，在番茄2号染色体长臂上成功克隆了Cnr位点编码的关键基因LeSPL-CNR[2]。不仅如此，研究发现Cnr遗传位点编码的LeSPL-CNR有以下两个显著特征：首先，Cnr突变体果实中LeSPL-CNR基因受表观遗传调控[2]。野生型和Cnr突变体LeSPL-CNR在核苷酸序列上没有差别，但Cnr突变体LeSPL-CNR启动子上游2。4 kb有一个286-bp DNA区域，其胞嘧啶甲基化水平特别高，相反野生型番茄却没有这种超甲基化现象，这个DNA区域的超甲基化抑制了LeSPL-CNR表达，造成突变体果实不能成熟，直接或间接调控果实质地等重要性状，首次揭示果实成熟转录调控网络中可能涉及到表观遗传调控因子[3]；其次，LeSPL-CNR mRNA 的3’-UTR区域有microRNA (miRNA)的靶位点。在真核生物中，miRNA在基因表达过程起重要调控作用[4]。MiRNAs大约21-25个核苷酸长，是由基因编码转录“茎-环”结构的RNA前体，经过Dicer酶加工形成的小RNA分子。成熟的miRNA与Argonaute蛋白互作并结合到与其序列互补的mRNA上，造成mRNA切割降解及/或抑制mRNA翻译[5]。在植物中，已发现miRNA在调控根冠形成[6]、叶的发育[7]、花的发育[8]和花粉萌发[9]等生长发育阶段中扮演重要的角色。

番茄LeSPL-CNR属于SPL（SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like）基因家族[10]。SPL基因首次在金鱼草中发现，它编码含SBP-box的蛋白，是植物中独有的一类转录因子（transcription factor），其功能和结构各不相同，但共享一个约80个氨基酸长高度保守的DNA结合区域，这个区域含有一个双向核定位信号（NLS）和两个潜在的锌指结构[11]。所确定的SBP-box基因中，番茄LeSPL-CNR与拟南芥的AtSPL3最为相似（前期未发表结果），后者与AtAP1和SQUAMSA基因启动子结合，在调节花的发育过程中发挥决定性作用。因此，探究番茄LeSPL-CNR的转录活性，对于进一步阐释LeSPL-CNR的细胞学和生物化学特性，从而揭示其转录调控果实成熟的生物学功能提供新的证据。

利用酵母系统检测转录因子的转录活性是指将待检测的转录因子全长或者部分片段克隆入酵母诱饵载体pGBKT7，并将重组后的诱饵载体转入酵母菌株AH109中。如待检测的转录因子全长或者部分片段含有自激活活性，那么相应片段的重组质粒即可结合至GAL4结合区域（即GAL4-BD domain），从而激活下游基因His3表达，从而使酵母菌株体能在缺色氨酸和组氨酸的平板（即SD/-Trp-His）上良好地生长。在本研究中，将番茄成熟关键转录因子LeSPL-CNR的氨基酸序列以SBP-box为核心分成4段，分别为靠近N端的序列（命名为NRT），含SBP-box序列（命名为SBP），含SBP-box在内的C端序列（命名为SC）和不含SBP-box在内的C端序列（命名为CRT）。将LeSPL-CNR全场序列（命名为CNR）以及上述4段氨基酸序列对应的核苷酸序列分别克隆入酵母诱饵载体pGBKT7，并利用酵母系统鉴定LeSPL-CNR的转录活性。

2。 材料与方法

2。1 实验材料

番茄野生型Ailsa Craig（AC），由杭师大生科院植物RNA信号研究中心提供。挑选籽粒饱满、大小一致的番茄AC种子若干颗，利用土培法于人工气候室进行培养。人工气候室的具体生长环境为：温度25℃，相对湿度60-70%，光照昼夜循环为16h白天/8h夜晚。论文网

2。2 实验试剂

植物总RNA抽提试剂盒（由QIAGEN公司提供），反转录试剂盒（由Tiangen提供），PCR产物割胶回收试剂盒（由QIAGEN公司提供），质粒抽提试剂盒（由QIAGEN公司提供），限制性内切酶及T4连接酶（由NEB公司提供），酵母YPDA培养基、SD/-Trp和SD/-Trp-His等相关试剂（由Clontech公司提供）。