ddH2O 6µl

Total 20µl

并利用如下PCR程序：

温度 时间

95℃ 2min

95℃ 30s

58℃ 30s

72℃ 20s

72℃ 10min

16℃ 30min

END

  取5µl溶液，用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，所用的DNA marker为marker为50bp。若条带正确，则送去测序进行进一步检验。

2。5 利用酵母系统检测转录活性

2。5。1。 预处理

1）配制250ml的YPDA固体培养基，250ml的YPDA液体培养基，250ml缺色氨酸的SD固体培养基（SD/-Trp），250ml缺色氨酸和组氨酸的SD固体培养基（SD/-Trp-His），100ml的40%葡萄糖溶液，250ml的ddH2O，在121℃下进行灭菌15min。

2）配制1。1×TE/LiAc试剂，PEG/LiAc试剂（冰浴，现用现配）。

2。5。2。 酵母菌株培养

挑取酵母菌株AH109适量，并划线至YPDA的固体培养基上，于30℃的培养箱中培养3-5天。

2。5。3。 挑单克隆

    挑取2-3个直径大小约为0。5cm的酵母菌株AH109，置于10ml的YPDA液体培养基中，在30℃摇床中培养过夜。

2。5。4。 制备感受态细胞

1）取上述培养过夜的酵母菌液适量，加入至50ml新鲜的YPDA液体培养基中，使OD值达到0。15左右；

2）放入30℃摇床，在200rpm下培养3-4h，使其OD值达到0。4-0。5左右；

3）700g，离心5min，弃上清后加入10ml的ddH2O进行重悬；

4）重复第3）步2-3次，直至培养液呈透明为止；

5）700g，离心5min，弃上清后加入0。5ml的1。1×TE/LiAc进行重悬；

6）将重悬后的菌液分装到1。5ml的EP管中；

7）最高速度离心15s，弃上清后加入300μl的1。1×TE/LiAc，并放在冰上备用。

2。5。5。 转化酵母AH109

1）将Carrier DNA取出10µl，放入95℃-100℃的金属浴中加热5min，然后马上置于冰浴备用；

2）分别加入100µg的重组后的pGBKT7质粒混匀；

3）加入100µl上述制备好的感受态细胞，加入后轻轻搅动混匀；

4）加入500µl的PEG/LiAc后涡旋10s；

5）放入30℃培养箱中放置30min，其中每隔10min摇一次；

6）加入20µl的DMSO试剂后涡旋10s；

7）放入42℃的金属浴中加热15min，其中每隔5min摇一次；

8）最高速度离心15s，去上清；

9）加入1ml的YPDA液体培养基；

10）放入30℃，250rpm摇床中摇30min-1h后取出；

11）最高速度离心15s，去上清；

12）加入200µl的ddH2O进行重悬；

13）取100µl分别涂布在SD/-Trp和SD/-Trp-His的平板上；

14）放入30℃的培养箱进行培养3-5d，观察并拍照记录。

3。 实验结果

3。1 RT-PCR克隆目的片段及酶切处理

利用特异性引物，以番茄幼叶cDNA为模板， 通过RT-PCR技术分别克隆得到目的片段单一的LeSPL-CNR的NRT序列、SBP序列和SC序列。回收目的基因片段，并利用双酶切技术处理上述目的片段