2。3 目的基因克隆

2。3。1。 RT-PCR：以4周龄的番茄幼叶为材料，利用QIAGEN公司提供的植物总RNA抽提试剂盒抽提总RNA，并利用北京天根公司提供的反转录试剂盒得到cDNA。以该cDNA为模板，设计特异性引物，利用PCR技术克隆LeSPL-CNR全长cDNA序列、NRT序列、SBP序列、SC序列和CRT序列。

2。3。2。 琼脂糖凝胶电泳：经过扩增的目的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，并利用割胶回收试剂盒回收正确的目的片段。

2。3。3。 酶切技术和连接反应：利用双酶切技术和T4连接酶介导的连接反应将上述片段克隆至酵母诱饵载体 pGBKT7中，分别得到BK-CNR，BK-NRT，BK-SBP、BK-SC和BK-CRT 等5个重组质粒，并进行测序验证。其中重组质粒BK-CNR和BK-CRT的构建工作由本实验室前人完成。

2。3。4。 酵母系统：分别将上述5种重组质粒转化入酵母菌株AH109，并涂布在缺色氨酸和组氨酸的平板（即SD/-Trp-His) 上培养3-5天，观察各个酵母菌株的生长状况，从而确定番茄关键转录因子LeSPL-CNR是否具有转录自激活活性。

2。4 酵母载体构建

2。4。1。 酶切技术和连接反应：利用双酶切技术处理酵母诱饵载体pGBKT7和目的基因回收片段，双酶切体系如下：

加样试剂 加样体积

质粒pGBKT7或者目的基因回收产物 约5µg

EcoRⅠ 5µl

BamHⅠ 5µl

Cut Smart 10µl

ddH2O up to 100µl

37℃温育3h，然后回收酶切后的目的片段。

2。4。2。 连接反应：利用T4连接酶介导的连接反应将上述片段克隆至酵母诱饵载体pGBKT7中，连接反应体系如下：

加样试剂 加样体积

酶切后的pGBKT7片段 约50ng

酶切后的目的基因片段 约100ng

10 × T4 ligase Buffer 1µl

T4 ligase 1µl

ddH2O up to 10µl

16℃连接3h，分别得到BK-NRT，BK-SBP，文献综述BK-SC等3个重组质粒，然后转化大肠杆菌感受态Trans1-T1（由北京全式金公司提供）。

2。4。3。 转化 

1）将上述连接产物10µl加入30µl的E。coil感受态，然后轻轻搅动；

2）马上放回去冰浴30min；

3）放入金属浴42℃，90s，不能超时；

4）再冰浴10min；

5）在PCR产物里加入400μl的LB液体培养基；

6）将管子用封口膜封好后放入37℃摇床中，摇40min，200rpm；

7）摇好后进行离心4000rpm，2min，去上清200µl；

8）剩下菌液混匀，取100µl涂布含卡那霉素的LB平板，并放入37℃进行培养过夜；

9）挑取8-10个单克隆分别加入1。5ml含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃摇床中培养过夜。

2。4。4。 菌液PCR检测

利用PCR技术检测上述克隆的假阳性情况，加样体系如下：

加样试剂 加样体积

2 × Taq Mix 10µl

目的基因上游引物（10µ游） 1µl

目的基因下游引物（10µM） 1µl

菌液