N6AMT基因和长链非编码RNA在褐飞虱生殖(2)
Takara公司提供；
大肠杆菌感受态细胞Trans5α，南京百斯凯公司提供；
PCR引物合成和序列测序，南京金斯瑞公司提供；
其他试剂均为国产AR级（分析纯试剂）或进口分装AR级产品。
1.1.2主要仪器设备
PCR仪Mastercycler personal，德国Eppendorf公司提供；
梯度PCR仪PCR Thermal Cycler Dice，日本Takara公司提供；
HE-120水平式核酸电泳仪，南京普阳科学仪器研究所提供；
凝胶成像仪一系统Gel Doc2000，美国Bio-Rad公司提供；
NANODROP 1000核酸蛋白分析仪，美国Thermo公司提供；
Mirco21 R微量台式离心机，美国Thermo公司提供；
离心机Centrifuge 5424，德国Eppendorf公司提供；
恒温金属浴CHB-100，杭州博日公司提供；
恒温振荡器ZAWY 200B，智诚公司提供；
涡旋混匀器，苏州捷美电子公司提供；
洁净工作台，上海博讯公司和上海苏净公司提供；
制冰机SIM-F 124，日本SANYO公司提供；
超低温冰箱906，美国FORMA公司提供；
超纯水器ElIX10，美国millipore公司提供；
高温灭菌锅SS-325，日本TOMY公司提供；
烘箱MC000712，美国MMM公司提供；
1.2供试昆虫的饲养
供实验用褐飞虱用水稻幼苗饲养在实验室养虫房内，控制温度为26±1摄氏度，湿度为70%到80%，光周期为16L:8D。采用无土栽培法种植水稻幼苗。每天用水壶浇适量的水，保持稻苗根部有合适的水量，待稻苗长至5cm左右可用于接种褐飞虱。每隔10天左右应将褐飞虱换入新的水稻苗盒中，确保其营养充足，迅速且大量地繁殖。
1.3总RNA的提取
1.3.1用于基因片段验证的总RNA提取
采用Trizol试剂进行总RNA提取，具体操作步骤如下:
1.取25-30mg褐飞虱成虫和若虫混样，放于匀浆器中，加入液氮研磨，之后加1 ml Trizol试剂，匀浆至没有明显的组织残片，将匀浆液放到离心管中。
2.40摄氏度12000g离心15分钟，保留上清液，转入新的一个离心管中。
3.上清液在15到30摄氏度中温育5分钟后加入0.2m1氯仿试剂，用力摇匀15秒,在15到30摄氏度中温育5 分钟。
4.4摄氏度12000g离心15 分钟，用移液枪小心将上层水相转移到新的离心管中，加入0.5 ml异丙醇轻轻混匀沉淀RNA，15到30摄氏度温育10分钟。
5.4摄氏度12000g离心10分钟。
6.抛上清液，用1 ml 75%乙醇清洗两次。用涡旋混匀器振荡样品，在4摄氏度7500 g下离心5 分钟。
7.在超净工作台内干燥10分钟左右，加30ml RNase-free水，用移液枪吸打混匀，置于-70摄氏度贮存备用。
用1.2%(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA完整性。使用核酸蛋白分析仪检测核酸的浓度和纯度，选择A260/A280在1.8-2.2之间且A260/A230大于2.0的RNA样品用作后续实验。
1.3.2用于RACE的总RNA提取
采用SV total RNA isolation system进行总RNA提取，其具体操作步骤为:
1.取约30 mg褐飞虱虫和若虫混样，放于匀浆器中，加入液氮研磨，之后加入175微升RNALysis Buffer，匀浆到没有明显的组织残片，将匀浆液倒入Ep管中。
2.匀浆液中加入350微升的RNA Dilution Buffer，来回颠倒使其充分混匀。