N6AMT基因和长链非编码RNA在褐飞虱生殖(5)
RACE cDNA模板 1μL
ddH20 11.75μL
LA Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.25μL
总体积 25μL
用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，用EB染色，在紫外灯下观察电泳结果，利用Gel Doc 2000凝胶成像系统拍照保存。
1.6分子克隆
1.6.1 PCR产物回收与纯化
利用Wizard. SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒对PCR的产物进行回收纯化，
操作步骤如下:
1.取1.5ml离心管并称重。
2.在紫外灯下切下含有所需DNA片段的琼脂糖凝胶，放入离心管中，再次称重，计算琼脂糖胶的重量。
3.按每10mg琼脂糖胶加入10μL Membrane Binding Solution比例加入溶液。
4. 50到65摄氏度温育10分钟，每2到3分钟取出混匀至凝胶块完全融化。
5.室温离心1分钟，然后转移到SV Minicolumn assembly中，室温静置1分钟。
6.室温16000g离心1分钟，抛弃滤液。
7.加入700微升己用乙醇稀释的Membrane Wash Solution，室温16000g离心1分钟，抛弃滤液。
8.加入500微升 Membrane Wash Solution，室温16000 g离心5分钟，弃滤液。
9.打开盖子，室温16000 g离心1 min，让残留的乙醇挥发。
10.将洗脱柱转移到一个新的1.5μL离心管中，加入3微升 Nuclease-Free水，室温静置1 分钟, 16000 g离心1分钟洗脱DNA。
11.回收后的DNA置于4摄氏度或-20摄氏度保存。
1.6.2连接反应
将回收的PCR产物连接于pGEM-T easy载体，反应体系如下:
2xRapid ligation buffer 2.5μL
pGEM-T Easy Vector (50ng) 0.5μL
PCR产物 1.5μL
T4 DNA ligase(3U/μL ) 0.5μL
总体积 5μL
将反应液充分混匀后置于4摄氏度中保存。
1.6.3转化反应
LB（Luria-Bertani）固体培养基:在液体培养基中加入1.5% (m/v)的琼脂糖粉，高压湿热环境灭菌20分钟，待温度降至40摄氏度左右时加入0.1%的氨苄，倒入已灭菌的培养皿中。LB液体培养基配制:Tryptone 1%, Yeast extract 0.5%, NaCl 1%，高压湿热灭菌20分钟。