N6AMT基因和长链非编码RNA在褐飞虱生殖(4)
5’-RACE-Ready cDNA 3’-RACE-Ready cDNA
总RNA 1.0-2.75μL（1μg）
5’-CDS Primer A 1.0μL
Deionized H2O Up to 3.75μL 总RNA 1.0-2.75μL（1μg）
5’-CDS Primer A 1.0μL
Deionized H2O Up to 3.75μL
3.轻轻弹管壁使其混匀。72摄氏度温育3分钟，再42摄氏度温育2分钟，14000 g离心10秒。
4.在5'-RACE-Ready cDNA中加入1μL SMARTer IIA oligo，在充分混匀之后离心。
5.准备Marster Mix:
Buffer Mix(来自第1步) 4μL
RNase Inhibitor (40 U/μL ) 0.25μL
SMART Scripe RTase(100 U) 1μL
总体积 5.25μL
6.将5.25微升的Master Mix分别加入两个管中。
7.轻轻混匀，短暂离心，42摄氏度温育90分钟， 70摄氏度温育10 分钟。
8.加入20微升Tricine-EDTA Buffer，置于-20摄氏度保存备用。
1.5 PCR反应
1.5.1普通PCR反应
普通PCR反应体系:
cDNA模板 1μL
Premix Taq 12.5μL
上游引物(10μmol/L ) 1μL
下游引物(10μmol/L ) 1μL
ddH20 9.5μL
总体积 25μL
1.5.2 RACE PCR反应
RACE PCR反应体系:
10x LA PCR buffer 2.5μL
MgCl2 ( 25 mM ) 2.5μL
dNTP Mixture(各2.5 mM) 4μL
UPM/NUPM 2.5μL
GSP/NGSP(10mmol/L) 0.5μL