N6AMT基因和长链非编码RNA在褐飞虱生殖(3)
3.70摄氏度温育3分钟(若温浴时间过长则可能损害RNA)。
4.室温12000一14000g离心10分钟
5.用移液枪将澄清的裂解液转入一新离心管中，注意避免碰到沉淀。
6.加入200微升95%乙醇，用移液枪吸打使其混匀。将此混合液转移至离心柱配装体中，室温12000一14000g离心l分钟。
7.从离心柱配装体上取下离心柱，抛弃收集管中的液体。将离心柱放回收集管内。加入600微升RNA Wash Solution用以洗涤RNA，室温12000一14000g离心l分钟。
8.重复一次步骤7。
9.配制Dnase I孵育混合物，每个RNA样品需40微升Yellow Core Buffer, 5微升,0.09M MnC12和5微升DNase I，用移液枪轻轻吸打混匀（不要震荡）。(DNase I必须在冰上解冻，用移液枪轻轻混匀)。
10.将50微升刚配制的DNase孵育混合物打到离心柱内的膜上，注意不要碰到膜同时要让溶液与膜接触并完全覆盖膜。
11.室温下温育1 分钟。然后向离心柱中加入200微升DNase Stop Solution，室温12000一14000g离心1分钟。
12.加入600微升RNA Wash Solution，室温12000-14000g离心1 分钟。
13.抛弃收集管内液体，向离心柱加入250微升 RNA Wash Solution，高速离心2分钟。
14.将离心柱从收集管转移到1.5m1带盖洗脱管上，向离心柱内的膜上加30微升RNase-free水，室温12000 -14000g离心1分钟，抛弃离心柱，盖好盛有RNA样品的洗脱管，置于-700C贮存备用。
提取的总RNA样品完整性、浓度及纯度的检测方法同第一章1.3.1。
1.4 cDNA的合成
1.4.1用于基因片段验证的cDNA合成
用PrimeScript RT Master Mix ( Perfect Real Time ) 快速反转录试剂盒进行cDNA的合成。具体操作步骤如下:
1.在没有RNA酶的离心管中配置反应液(应在冰上进行):
总RNA ＜8μL（500ng）
5xPrimeScript RT Master Mix 2μL
RNase Free dH20 up to 10μL
2.反应条件如下:
37摄氏度，15分钟;；85摄氏度， 5秒；4摄氏度保温
合成的cDNA样品置于-20摄氏度保存备用。
1.4.2用于RACE的第一链cDNA合成
利用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit进行5'-RACE cDNA和3'-RACE
cDNA的合成，具体操作步骤如下:
1.对于每10μL体系的cDNA合成反应，首先配制Buffer Mix，体系如下:
5xFirst-strand Buffer 2μL
DTT ( 20 mM ) 1μL
dNTP Mix(10 mM) 1μL
总体积 4μL
2.在两个离心管中分别混合以下试剂：