水稻粉质突变体F41的基因定位(2)
淀粉合成代谢相关基因的突变多数会引起淀粉含量和结构改变。目前，报道的与淀粉相关的突变体主要包括垩白、皱缩、粉质等类型[8]。其中粉质突变体有flo1、 flo2、 flo3、 flo4、 flo5、 flo6、 flo7[8-14]。 突变体flo1稻米籽粒粒型正常，在I-KI溶液中染成深蓝色，胚乳细胞中淀粉颗粒折叠松散[9]；突变体flo2通过影响胚乳中储藏物质的积累对水稻种子的大小和淀粉的质量形成过程中起到关键的调控作用，图位克隆将其定位在第4条染色体上，与水稻种子发育过程中的耐热性有关[10]；突变体flo3含有较低水平的16-kDa过敏蛋白[11]，该蛋白是患有遗传性皮肤炎的病人摄入后的主要过敏原[15]，遗传分析，该蛋白是由一个隐性基因控制，但是它和控制粉质基因紧密连锁，未能成功将其分离；突变体flo4是一个T-DNA插入突变体，胚乳为白色，但外部正常，扫描电镜分析表明是由于胚乳中淀粉颗粒组成松散造成的[8]， T-DNA插入到了OsPPDKB基因的第五个内含子中，该基因编码丙酮酸磷酸双激酶，该酶在水稻种子的乳熟期大量积累[16]，因而该基因主要调控水稻种子灌浆期的碳代谢；突变体flo5也是一个T-DNA插入突变体，是为了研究SSIIIa在淀粉合成中的作用，与野生型相比，突变体胚乳中淀粉颗粒更小更圆，研究发现SSIIIa在控制水稻淀粉支链相对长度上起着重要作用[13]；突变体flo6是在组织培养过程中获得的突变体，其突变基因位于第三条染色体上， flo6的N端与淀粉异构酶ISA1结合调控淀粉的合成[14]；突变体flo7是从粳稻品种日本晴组培后代中获得的一个稳定遗传的胚乳粉质突变体，突变体表现为白色不透明粉质，突变体种子粒长增加，而粒宽、粒重和千粒重均显著下降[8]。
本研究以粉质突变体F41为研究材料， F41是宁梗3号经化学诱变剂N-甲基N-亚硝基脲(MNU)处理后，筛选到的胚乳粉质突变体。该突变体与一个籼稻品种Dular配组得到F1， F1单株自交收获F2的种子，利用F2群体分离出的具有粉质表型的极端个体对突变基因进行初定位，为F41基因的进一步克隆与功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
粉质突变体F41来源于籼稻品种宁粳3号经化学诱变剂 MNU 处理后，筛选到的稳定遗传的胚乳粉质突变体。突变体F41与籼稻品种Dular配组得到 F1，F1 自交得 F2，在 F2 中挑选具有粉质表型的个体对突变基因展开定位研究。材料正季种植于南京农业大学土桥实验基地。
1．2 方法
1.2. 1 突变体与野生型的表型鉴定
剥去成熟的野生型和突变体种子的颖壳，在解剖镜下观看， 野生型表现为透明，而突变体则表现为胚乳粉质不透明。
1.2. 2 种子发苗
收获的 F2 种子自然干燥后，在灯箱下挑选具F41表型的种子，剥去颖壳，用无菌水冲洗3-5次，然后将种子移至无菌滤纸上吸干种子表面的水分，最后将种子分散放置在垫有两层滤纸的培养中，用无菌水将滤纸润湿，然后将培养皿放置在 30℃的培养箱中培养，注意，每天要换水。待苗长到三叶一心时提取DNA。
1.2. 3 水稻总 DNA 的提取方法（CTAB 法）
提取 DNA 时步骤如下：
① 取适量水稻叶片于2mL离心管中，并放入钢珠；
② 液氮冷冻之后，用磨样机磨碎；
③ 加入600-700L 预热到65℃CTAB，然后放入65℃水浴锅中温浴30min，期间上下颠倒几次；
④ 加入与CTAB等量的24:1(氯仿与异戊醇的体积比)，轻轻摇动后静置15min;
⑤ 13000rpm离心5min，吸200或400L上清液于新的1.5mL离心管中；
⑥ 加0.6倍所吸上清液体积的异丙醇摇匀后，于-20℃冰箱中静置30min；
⑦ 13000rpm离心 5min，弃上清；