pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对lux box启动的影响(5)
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2.1.4. 培养基及试剂的制备
TBK培养基：称取10g胰蛋白胨，7gKCl，20.93gMOPS，溶解于1L蒸馏水中，灭菌前用HCl、KOH调pH至5.72，121℃高压灭菌30min。
LB液体培养基：称取25g LB medium Broth, 溶解于1L蒸馏水中。
LB固体培养基：称取25g LB medium Gel, 溶解于1L蒸馏水中。
IPTG100×：0.238gIPTG粉末、10mL超纯水。0.2μm滤膜过滤。
卡那霉素1000×：0.5g卡那霉素粉末、10ML超纯水。0.2μm滤膜过滤。
不同浓度3-oxo-C6-HSL：由1.75mM3-oxo-C6-HSL-甲醇溶液稀释，1.75mM 3-oxo-C6-HSL-甲醇溶液为原实验室储存液。
TAE缓冲液（1×工作液）：量取10ml50×TAE浓缩液，加入到490ml超纯水中。室温保存，不必灭菌。
2%X-Gal溶液：称取2gX-Gal溶于100ml二甲基甲酰胺（DMF）中，至于阴暗处，不用灭菌，-20度保存。
2.2. 实验方法
2.2.1. 细菌扩大培养
从甘油冻存管中刮取含有pPopctrl质粒的top10F’菌株，接种于LB（含50 μg/mL的Kanamycin）培养基中，37℃、200 r/min振荡培养过夜，倍比稀释后涂布LB平板，37℃温育24 h，用接种环挑取单菌落接种于5 mL LB（含50 μg/mL的Kanamycin）培养基中，37℃、200 r/min振荡培养15 h，作为实验接种液。
2.2.2. 菌株筛选
为了鉴别不同时间点样品中的野生型和突变型，本课题利用二者生长曲线的不同区分之。具体做法是：培养过程中不同时间点取样，倍比稀释涂布90 mm LB平板，培养后从中随机挑取30个单菌落，接种于96孔板中，每孔中加200 μL TBK培养基，其中含Kanamycin和1 mmol/L IPTG，接种后每孔再加50 μL矿物油封顶以防蒸发。预留2孔，其中TBK分别含与不含IPTG，此2孔接种野生型菌株分别作为阳性、阴性对照。将该96孔板置于Plate Reader V3中30℃孵育，每隔10 min振板30 s并测定OD600，连续测定18 h以上。绘制30个孔中30个单菌落的OD-时间生长曲线，与对照孔相比较，确定其中野生型和突变型的数量。
2.2.3. 突变菌株的质粒提取和测序
为了研究突变发生的位点，在不同时间点和不同IPTG浓度的菌液样品中随机挑选6株突变菌，LB扩大培养后用试剂盒抽提质粒，电泳检测后送上海迈浦生物技术有限公司测定质粒全长序列。测序结果用Vector NTI软件与pPopctrl质粒原始序列比对。
2.2.4. 突变质粒转化不含任何质粒的top10F’菌株后的生长曲线测定
为了研究是否质粒上的突变足以使宿主逃脱群体感应自杀行为，本文选择将2个已被证实的并已测序的突变质粒重新转化到不含任何质粒的野生型top10F’宿主菌中去，构建只有质粒突变的准野生型细菌，将9 μL接种液分别接种于9 mL TBK培养基（含50 μg/mL的Kanamycin）中，培养基分别含IPTG浓度为0.01、0.05、0.08、0.1、1 mmol/L，并以不加IPTG的培养基作为对照。30℃、250 r/min振荡培养，间隔1.5~2 h取样200 μL于96孔板中先后测定OD600和CFU，绘制生长-时间曲线。
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