pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对lux box启动的影响(6)
2.2.5. 扩菌保种
扩菌：分别接种野生型和2412至LB液体培养基中（pH=5.72），培养12小时左右。
制备LB固体培养基：称取LB固体培养基，高温高压灭菌。待培养基冷却至50℃左右，按培养基总体积千分之一的比例，加入卡那霉素至LB固体培养基中，摇匀，依次浇注培养皿，制作平板。待LB固体培养基冷却凝固后，加入100nmol/LIPTG溶液20ml，和100μL2%X-Gal溶液，均匀涂抹于培养基表面，37摄氏度下烘干待用。此外准备一批平板，按以上的量，不加 IPTG，只加X-Gal，作为对照。
稀释：取12小时的菌液100μL至已灭菌的96孔板中，吸取其中20μL加入到180μL的超纯水中，稀释了10倍。以次类推，将菌液稀释到10-7。
涂布：分别吸取各稀释液100μL，涂布于制备好的平板上。待菌液被培养基完全吸收后，倒置平板与培养箱中，37℃下过夜。
2.2.6. 构建质粒LuxR-GFPuv2
a. 抽提野生型和2402大肠杆菌质粒
1. 取1.5～5ml过夜培养的菌液，8000×g离心2min，收集菌体，弃尽上清。
2. 在沉淀中加入250μl Buffer 1，彻底悬浮菌体。
3. 加入250μl Buffer2，立即温和颠倒离心管5～10次，室温静置2～4min。
4. 加入350μl Buffer3，立即温和颠倒离心管5～10次混匀。
5. 12000×g离心5～10min，将上清液移入吸附柱，8000×g离心30s，倒掉收集管中液体。
6.加入500μl Wash Solution ，9000×g室温离心30s，倒掉收集管中废液。
7. 将Gen Clean Column重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。
8. 重复步骤7一次。
9. 空吸附柱于9000×g，离心1min。
10. 将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl～70μl Elution Buffer，室温静置1min。室温离心1min，离心管中的液体即为包含目的质粒的溶液，取2～5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化好的DNA可立即用于后续实验或-20℃冻存。
b. 质粒检测
1. 制备凝胶
称0.3g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入30 mL 1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其凉到60℃左右，加入0.5uL溴化乙锭（EB）轻轻摇荡倒入封好的电泳板上。
2. 放胶
取出凝胶，放入电泳槽内。
3. 上样
1）吸取5uL质粒，加入2uL上样缓冲液（Loading buffer）、5uL超纯水，混匀。
2）将质粒样品点入到琼脂糖凝胶的上样孔中。
4. 电泳
连接好电泳槽和电泳仪，以100V恒压电泳。电泳35min后，关上电泳仪。
5. 结果观察
将凝胶放到紫外灯成像系统下观测,记录观察到的电泳条带。
c. 扩增目标基因
设计一对引物，以117的质粒为模板，通过PCR的方法，获取GFPuv2片段。反应体系见表2-4
表2-4 PCR反应体系
试剂 体积
2×Taq酶PCR混合液 25uL
上游引物（gfp1031f） 1uL
下游引物（gfp2841r） 1uL
模板DNA
超纯水 2uL
21uL
d. 酶切
利用AatII酶，分别酶切野生型和2412的质粒，切除该质粒上的Luxbox-CcdB基因。同时，尝试利用该酶，切除PCR产物上的引物。37摄氏度下反应1小时。65摄氏度下灭活20分钟。酶切完进行电泳，检验酶切效果。反应体系见表2-5
表2-5（a） 质粒DNA酶切反应体系
试剂 体积
10×Buffer Tango 2uL
Aat II 2uL
DNA 5uL
超纯水 11uL
表2-5（b） PCR酶切反应体系
试剂 体积
10×Buffer Tango 2uL
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