结果显示:与野生型细菌明显的自杀行为不同,1408’和2412’对IPTG均不敏感,没有自杀现象发生,其生长曲线与1408和2412没有显著差异。这说明:突变型个体摆脱群体感应、逃避自杀回路控制是由于外源片段插入luxR基因造成的。
3.4.    抽提质粒
为了探究突变的luxR基因在自杀回路中工作的具体机制,实验中准备构建两个新的质粒,分别以野生型和突变型2412为改造对象,将其中的CcdB基因用GFPuv2代替。新质粒的构建的前提是获得正确的载体质粒和目标基因。而载体质粒是从原始质粒上酶切所得。本次所拼接的质粒所需片段如下表所示:
表3-1  实验中所用生物元件

基因部件    描述    长度
GFPuv2    编码表达GFP蛋白,借助仪器可观察到绿色荧光    878bp
长片段1    以pPopctrl质粒为原质粒,去除CcdB基因    3719bp
长片段2    以突变型2412质粒为原质粒,去除CcdB基因    4613bp
长片段1和长片段2依次在AatII酶的作用下,发生酶切反应,切下长片段。再通过割胶回收,获得目标片段。野生型质粒和2412的质粒验证如下图所示:
 
图3-1  原始质粒电泳验证图
Fig. 3-1 The electrophoresis of plasmid of wide type and mutant type 2412
从电泳图上可知,野生型质粒和突变型2412均出现一条清晰条带。野生型质粒为4727bp,突变型2412为5621bp。通过Marker可知,该两条条带为目标条带。
3.5.    PCR产物
GFPuv2基因来源于117菌株的质粒,我们通过体外扩增的方法来获得目的基因。经过讨论,确定PCR反应条件为:94℃5分钟,94℃30秒,52℃45秒,72℃1分钟(30次循环),72℃7分钟,4度保存。
引物设计:
引物设计同样考虑到标准化部件的设计需要,在基因序列的两端分别添加两个酶切位点。同时,在每个酶切位点前添加一个保护序列。
引物信息见表3-2如下:    
表3-2  实验中所用生物元件
Primer名称    序列(5'to3')    碱基数
gfp2841r    ccatccagtttactttgcag    20
gfp870f    attgacgtcaagcttttatttgtagagc    20
att是保护序列,gacgtc是AatII位点,从c开始是模板的870-851段互补序列,再后面aagctt是HindIII位点。
根据设计好的引物和PCR体系,克隆GFPuv2基因,琼脂糖电泳结果如图3-2所示:
 
图3-2  GFPuv2基因电泳验证图
Fig. 3-2 The electrophoresis of PCR product
从琼脂糖电泳图中可知:在1000bp左右得到一个亮带,与目标片段的大小相一致。
3.6.    酶切质粒和PCR产物
正如前文所述,长片段1、长片段2分别是以野生型和突变型2412原始质粒为载体,在AatII酶作用下,发生酶切反应所得。通过反复尝试,将酶切反应时间定为2小时。酶切结果如下图3-3所示:

图3-3  WT、2412酶切2小时电泳验证图
Fig. 3-3 The electrophoresis of Enzyme digestion product
从电泳图中可知:在5000bp左右出现清晰明亮条带,在1000bp左右出现较暗的条带。经过核对,明亮的条带出现的位置符合野生型和突变型原始质粒去除CcdB基因后的线性质粒的大小,与目标片段大小一致。
同样,由于在引物设计时,给GFPuv2一端加上了AatII酶切位点。因此,可以利用AatII酶来切除引物。多次尝试后,确定酶切反应时间为2小时。酶切产物电泳验证如下图3-4所示:
 
         图3-4  PCR产物酶切2小时电泳验证图
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