突变体是指生物体的某个性状发生可遗传变异或某个基因发生突变。常用的构建植物突变体库的方法主要有以下3种,(1)理化诱变突变体库(2)植物转座子标签突变体库(3)农杆菌介导的DNA插入突变体库。
化学诱变构建突变体库最常用的方法是采用烷化剂,如:N-甲基-N-亚硝基脲(Methylnitrosourea,MNU)、甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate,EMS)等化学试剂诱变,除使用烷化剂诱变外,碱基类似物,如:5-溴-尿嘧啶;抗生素,如:链霉黑素以及诸如亚硝酸等的其它类型诱变剂;物理因素诱变构建突变体库则经常使用X射线、γ射线等物理辐射对植物种子进行处理。再对经过理化诱变处理的植物表型进行观察、对比,从而构建通过理化诱变获得的突变体库[4]。这些诱变剂往往会引起植物基因组的DNA发生突变。例如EMS引起的突变会使DNA发生G到A的点突变。
转座子(transposon)是大部分生物染色体上的可移动的遗传因子,又被称为跳跃基因。转座子标签库是指把转座子插入植物基因组引起插入位点的基因失活,从而构建出植物突变体库,有转座子和逆转座子两类。玉米Ac/Ds(Activator/Dissociation)转座子系统是转座子标签构建突变体中常见的转座子系统。而在水稻当中,也已经成功使用Ac转座子作为分子标记构建出了水稻突变体库[5-6]。在水稻中,Tosl0、Tosl7、 Tosl9、Tos25和Tos27这五种逆转座子已经被证明具有一定的转座活性。在这些具备转座活性的水稻转座子中,Tosl7拥有最强的转座活性[7-8]。已经有学者成功构建出了水稻大型Tosl7插入的突变体库,而突变体相关的T-DNA数据库也正在被不断完善[9]。
Ti质粒(Ti plasmid)为植物根癌农杆菌(Agrobactertium tumef-aciens)菌株中存在的质粒,其中的冠瘿碱合成基因和冠瘿瘤生长基因可以与植物核内DNA组合来表达信息,这一DNA区段就是T-DNA。Ti质粒既有在细菌中表达的基因,又有在高等植物中表达的基因,具有整合到植物基因组的特性。农杆菌转化法向植物基因组中插入目的DNA的原理就是将农杆菌中的T-DNA替换成外源目的基因或其他元件,以Ti质粒作为外源基因的载体将目的基因整合到植物的基因组中。T-DNA插入的靶位点附近,植物基因功能会产生变化。基因功能产生变化的种类是由插入位点的位置决定的,如果插入位点在植物基因的编码区,就有可能导致靶位点的基因失活;如果T-DNA插入位点位于非翻译区,则多个基因的表达量可能会同时发生变化。
随着上世纪70年代以来,理化诱变构建人工突变体的方法在育种中的大范围应用,以及农杆菌转化法和转座子标签等突变体构建的方法的发展,使突变体研究获得了巨大的进步[10-11]。随着水稻全基因组测序的完成,水稻突变体已被广泛应用于水稻的连锁分析、基因克隆和功能分析[12]。文献综述
由于水稻突变体直接联系着水稻的突变基因,构建水稻突变体库并对水稻突变体进行筛选,对于水稻功能基因的研究具有重大意义,也是最具有说服力的研究方法[13]。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以粳稻中花11为野生型亲本,转化得到的水稻突变体种子。对照品种为亲本水稻,粳稻中花11(Oryza Sativa L.Subsp.Japonica, cv.Zhonghua 11)。
1.2 实验方法
1。2。1 水稻的种植与耐镉株的筛选
选出颗粒饱满的水稻种子,浸泡12h后倒至垫有湿润滤纸的平板上进行约3d的催芽,发芽后,种植于塑料网上,漂浮在水培箱中后,置于光照培养箱中培养。待幼苗生长约7天时,移至温室并加入木村营养液培养。木村营养液配方如下:(NH4)2SO4 48。20mg/L,KH2PO4 24。80mg/L,KNO3 18。50mg/L,K2SO4 15。90mg/L,Ca(NO3)2 59。90mg/L,MgSO4 65。90mg/L,Na2SiO4 100mg/L,H2BO3 2。86mg/L,CuSO4•5H2O 0。08mg/L,ZnSO4•7H2O 0。22mg/L,MnCl2•4H2O 1。81mg/L,Na2MoO4•2H2O 0。09mg/L,Fe-EDTA 1ml,pH值5。5[14]。待水稻植株长出第二片叶时,开始进行Cd处理,每隔2天更换一次营养液及Cd处理液,处理液中Cd2+浓度为100μmol/L,处理约15-20天时,拍照并进行根长及株高的测量。