本实验从西溪湿地的沉积物中采集样本，分离纯化得到若干菌株，并从中筛选出一株产蛋白酶和淀粉酶活性最高的较优菌株XB235，对其进行形态鉴定、生理生化鉴定、分子鉴定，鉴定出该菌株所属的属、种，为下一步详细研究其产酶特性及生产用途作铺垫，提供必要的理论基础。

1材料与方法

1。1菌种

菌株XB235：从杭州西溪国家湿地公园保护区湿地植物园水底沉积物中分离得到。

1。2主要试剂

 细菌蛋白胨（上海源叶生物科技有限公司），胰蛋白胨（英国 Oxoid 公司），酸水解酪蛋白（Solarbio 公司），引物、琼脂和琼脂糖（上海生工生物工程有限公司），NaCl等常规药品及试剂均为国产分析纯，Taq DNA 聚合酶、DNA Marker（TaKaRa 公司），细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司）。

1。3培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、Nacl5g/l、琼脂15g/L、蒸馏水1000mL、PH7。2~7。4，120℃高压灭菌15分钟。

产蛋白酶筛选培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、Nacl5g/l、琼脂15g/L、蒸馏水1000mL、1%脱脂牛奶，PH7。2~7。4。

产淀粉酶筛选培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、Nacl5g/l、琼脂15g/L、蒸馏水1000mL、1%可溶性淀粉，PH7。2~7。4。

V-P试验培养基：水：500ml、蛋白胨：3g、K2HPO4:3g、葡萄糖：3g、PH：7。0~7。3。

明胶水解试验培养基：明胶：100g、蛋白胨：5g、水：1000ml、PH：7。2~7。3。

柠檬酸水解试验培养基：柠檬酸钠：2g、MgSO4：0。2g、亚磷酸氢氨：0。5g、酚红液：0。04%20ml、蒸馏水：1000ml。

吲哚试验培养基：1%的胰胨水溶液、PH：7。2~7。5，120℃高压灭菌30min。

苯丙氨酸脱氢酶试验培养基：酵母膏：2g、Na2HPO4：1g、苯丙氨酸：2g、氯化钠：5g、琼脂：10g、蒸馏水：1000ml、PH：7。0~7。2,120℃下蒸汽灭菌10min。

卵黄磷脂酶试验培养基：在无菌的条件下，去适量卵黄，并加入等量的生理盐水，振荡，混合均匀。取10ml加入到约为50℃左右的肉质胨琼脂中，混合均匀。最后将悬液倒入培养皿中，冷却，制成平板。

甲基红试验培养基：葡萄糖：5g、蛋白胨：5g、Nacl：5g、蒸馏水：1000ml、PH：7。0~7。3。在120℃的条件下灭菌30min。

丙酸盐试剂培养基：硫酸铵：2g、磷酸二氢钾：0。4g、Nacl：1。5g、磷酸氢二钾：0。6g、酵母膏：1g、溴百里酚蓝：0。03g、丙二酸钠：3g、蒸馏水：1000ml、PH：7。0~7。5。在120℃的条件下灭菌15min。（本实验还需要设置一个不添加丙二酸钠的培养基作为空白对照实验。）

酪蛋白水解试验培养基：1%脱脂牛奶、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、Nacl5g/l、琼脂15g/L、蒸馏水1000mL，PH7。2~7。4。

1。4主要设备

722 型分光光度计（上海江仪仪器有限公司）；WH861 型漩涡振荡器（江苏太仓华利达实验室设备公司）；超净工作台（SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台）； Zealway GI54DS 型高压蒸汽灭菌锅（厦门致微仪器有限公司）；FPG 系列多段可编程光照培养箱（宁波莱福科技有限公司）；微量移液器（德国 Eppendorf）；光照振荡培养箱（江苏太仓华利达实验室设备公司）5417R型高速冷冻离心机（德国 Eppendorf）；PCR仪（美国 ABI）；DM6000B 光学显微镜（德国  leika）；冰箱（海尔集团）；凝胶成像系统（Tanon）；电子分析天平（Mettler Toledo PL203）；磁力搅拌器（JB-3）；HH-4 型数显恒温水浴锅（金坛市富华电器有限公司）；电热鼓风干燥箱（101-2型）。

  1。5样品采集

在杭州国家西溪湿地公园的湿地植物园野外观测样地选择4个采样点， 采集0~10cm的表层沉积物，每个采样点的编号为1~4号。采集到的样品迅速放入无菌保鲜袋中，在4℃保存用于菌株分离。