本实验从西溪湿地的沉积物中采集样本,分离纯化得到若干菌株,并从中筛选出一株产蛋白酶和淀粉酶活性最高的较优菌株XB235,对其进行形态鉴定、生理生化鉴定、分子鉴定,鉴定出该菌株所属的属、种,为下一步详细研究其产酶特性及生产用途作铺垫,提供必要的理论基础。

1材料与方法

1。1菌种

菌株XB235:从杭州西溪国家湿地公园保护区湿地植物园水底沉积物中分离得到。

1。2主要试剂

 细菌蛋白胨(上海源叶生物科技有限公司),胰蛋白胨(英国 Oxoid 公司),酸水解酪蛋白(Solarbio 公司),引物、琼脂和琼脂糖(上海生工生物工程有限公司),NaCl等常规药品及试剂均为国产分析纯,Taq DNA 聚合酶、DNA Marker(TaKaRa 公司),细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)。

1。3培养基

牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、Nacl5g/l、琼脂15g/L、蒸馏水1000mL、PH7。2~7。4,120℃高压灭菌15分钟。

产蛋白酶筛选培养基:牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、Nacl5g/l、琼脂15g/L、蒸馏水1000mL、1%脱脂牛奶,PH7。2~7。4。

产淀粉酶筛选培养基:牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、Nacl5g/l、琼脂15g/L、蒸馏水1000mL、1%可溶性淀粉,PH7。2~7。4。

V-P试验培养基:水:500ml、蛋白胨:3g、K2HPO4:3g、葡萄糖:3g、PH:7。0~7。3。

明胶水解试验培养基:明胶:100g、蛋白胨:5g、水:1000ml、PH:7。2~7。3。

柠檬酸水解试验培养基:柠檬酸钠:2g、MgSO4:0。2g、亚磷酸氢氨:0。5g、酚红液:0。04%20ml、蒸馏水:1000ml。

吲哚试验培养基:1%的胰胨水溶液、PH:7。2~7。5,120℃高压灭菌30min。

苯丙氨酸脱氢酶试验培养基:酵母膏:2g、Na2HPO4:1g、苯丙氨酸:2g、氯化钠:5g、琼脂:10g、蒸馏水:1000ml、PH:7。0~7。2,120℃下蒸汽灭菌10min。

卵黄磷脂酶试验培养基:在无菌的条件下,去适量卵黄,并加入等量的生理盐水,振荡,混合均匀。取10ml加入到约为50℃左右的肉质胨琼脂中,混合均匀。最后将悬液倒入培养皿中,冷却,制成平板。

甲基红试验培养基:葡萄糖:5g、蛋白胨:5g、Nacl:5g、蒸馏水:1000ml、PH:7。0~7。3。在120℃的条件下灭菌30min。

丙酸盐试剂培养基:硫酸铵:2g、磷酸二氢钾:0。4g、Nacl:1。5g、磷酸氢二钾:0。6g、酵母膏:1g、溴百里酚蓝:0。03g、丙二酸钠:3g、蒸馏水:1000ml、PH:7。0~7。5。在120℃的条件下灭菌15min。(本实验还需要设置一个不添加丙二酸钠的培养基作为空白对照实验。)

酪蛋白水解试验培养基:1%脱脂牛奶、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、Nacl5g/l、琼脂15g/L、蒸馏水1000mL,PH7。2~7。4。

1。4主要设备

722 型分光光度计(上海江仪仪器有限公司);WH861 型漩涡振荡器(江苏太仓华利达实验室设备公司);超净工作台(SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台); Zealway GI54DS 型高压蒸汽灭菌锅(厦门致微仪器有限公司);FPG 系列多段可编程光照培养箱(宁波莱福科技有限公司);微量移液器(德国 Eppendorf);光照振荡培养箱(江苏太仓华利达实验室设备公司)5417R型高速冷冻离心机(德国 Eppendorf);PCR仪(美国 ABI);DM6000B 光学显微镜(德国  leika);冰箱(海尔集团);凝胶成像系统(Tanon);电子分析天平(Mettler Toledo PL203);磁力搅拌器(JB-3);HH-4 型数显恒温水浴锅(金坛市富华电器有限公司);电热鼓风干燥箱(101-2型)。

  1。5样品采集

在杭州国家西溪湿地公园的湿地植物园野外观测样地选择4个采样点, 采集0~10cm的表层沉积物,每个采样点的编号为1~4号。采集到的样品迅速放入无菌保鲜袋中,在4℃保存用于菌株分离。

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