参考文献 8

引言

    京大戟的又一个名称为大戟、龙虎草等，是大戟科大戟属植物大戟(Euphorbia pekinensis Rupr)的干燥根。京大戟性味苦论文网、寒、有毒，是我国传统中药，记载于历版《中国药典》，在医疗中是能够起到峻下逐水作用的药草，起到泄水逐饮，解毒、活血、散结、通络的效用[1]。在临床上，肾炎水肿、胸腹积水、肝硬化以及精神异常等病症经常用大戟作为治疗药物[2-4]。同时还有三萜、黄酮、鞣质和有机酸等化学成分，因此具备了显著的利尿作用。目前对于京大戟的化学成分和药理作用已经具有一定的研究基础，从京大戟中分离到了多种结构复杂的化合物，药理研究中发现京大戟分离的化合物具有抗肿瘤、抗白血病、镇痛、消炎等药理作用[5]。临床研究还发现京大戟具有治疗精神分裂症、肝硬化腹水、便秘、耕牛前胃弛缓等疗效。但京大戟具有毒性，这个属性限制了京大戟的应用。京大戟的化学成分中，毒性成分大部分为二萜类化合物，但是大戟二萜类的成分具有明显的抑制肿瘤的作用。目前，国内的和国际上的的研究者通过分离获得了50多种碳骨架构造类型的二萜类化合物。研究说明其中产生毒理作用的化合物大多是四环二萜（巴豆烷型与巨大戟烷型）和三环二萜（瑞香烷型）以及大环二萜类成分。

    细胞色素P450(cytochromeP450 ,简称P450）是血红蛋白大家族中极其重要的成员，往往和内质网、质体、线粒体、高尔基体等细胞器膜结合，分布在生命进化过程中的所有分支[6-8]。催化有机化合物的氧化还原反应是它重要的效用，细胞色素P450是单加氧酶其中的一种，单加氧酶反应是它催化蛋白的很重要的反应，所以细胞色素P450又一个名称被叫做单加氧蛋白P450[9]。细胞色素P450在自然界以单体或二聚体的形式普遍存在[10]，主要由于修饰，使得它多种多样。CYP450参与了植物中多种结构产物，特别是多结构类型的萜类化合物的合成[11-12]。本研究克隆了药用植物大戟二萜类合成途径中的一个CYP450基因--贝壳杉烯氧化酶（ent-kaurene oxidase, KO）基因，并对该基因进行了生物信息分析，对药用植物大戟根茎叶组织中的ko基因的表达差异也进行分析，探讨药用植物大戟二萜类成分与ko基因表达量的关系[13]，为表明药用植物大戟产生毒理作用的毒性物质合成途径提供理论根据，并为运用基因工程使中药材质量进步打下了根底。

1 实验材料与方法文献综述

1。1 实验材料与仪器

    材料：药用植物大戟取自江苏师范大学后山。经ITS序列鉴定为药用植物大戟。仪器：研磨皿，移液枪，小型离心机，恒温水浴锅，高压灭菌锅，电子天平，无菌操作台，电泳仪。 

1。2 实验主要试剂

    从天根生物科技有限公司购买获得植物RNA提取试剂盒，从宝生物（大连）有限公司购买获得反转录试剂盒，从南京诺唯赞生物科技有限公司购买获得高保真酶，从Transgen生物科技有限公司购买获得质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、DNA连接试剂盒。

1。3 实验方法

1。3。1 药用植物大戟根、茎、叶总RNA提取 

    按照植物RNA提取试剂盒的提取步骤，提取药用植物大戟根、茎和叶的总RNA。总RNA通过电泳检测RNA的完整性，用比色法测定提取RNA的质粒和浓度[14]。

1。3。2 反转录及PCR扩增

    以药用植物大戟根的总RNA为模板，参照PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书反转录成cDNA，-20℃保存备用。根据前期测的转录组序列设计引物，上游引物为BXKO1F: 5’-ATGGATGTAATTATCAACACAAAT-3’；下游引物为BXKO1R: 5’-TTAGATTCTTGGCTTTATGATGGC-3’。以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：去离子水18μL，2 × Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix (10 mM each) 1μL，cDNA 1μL，引物各1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL。反应程序：95 ℃预变性1 min; 95 ℃变性15s， 60 ℃退火15s，72 ℃延伸1 min，35 个循环，最后72 ℃延伸5min。取5 μL 扩增产物在1 %琼脂糖凝胶电泳上检测[15]。