2。2。6、氨基酸分析 5

3、结果 5

3。1、T1R1和T1R3 在HC11细胞系中的表达 5

3。2、siRNA沉默T1R1抑制β-酪蛋白合成 5

3。3、siRNA沉默T1R1阻断mTOR信号通路 6

3。4、T1R1/T1R3和氨基酸转运蛋白抑制剂对mTOR通路

     的抑制作用是加性的 7

4、讨论 9

5、致谢 10

6、参考文献 11

1、前言

    越来越多的证据表明，氨基酸不仅可以作为蛋白质的合成原料，也可以作为调节牛奶合成和泌乳的信号分子[1]。最近饲料中的氨基酸在翻译水平方面调节牛奶蛋白质合成已有研究[2]。离体条件下，氨基酸的可用性是乳蛋白合成的主要限制因子[3]。亮氨酸增加了小鼠和牛乳腺上皮细胞的β-乳球蛋白的合成[4]。从培养基中去除异亮氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸也会影响奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白的合成。[5] 在体内，亮氨酸独自增加乳蛋白产量，估计最大可消化亮氨酸140 g／d[6]。缬氨酸的缺乏会降低乳蛋白的含量，并且会降低用于乳蛋白合成的氮利用效率[7]。均衡供给必需氨基酸可以提高乳蛋白产量和含量[8]。在两个层次的蛋白质供应平衡必需氨基酸的分布提高乳蛋白的产量和代谢蛋白质的效率，这两个层次分别是在蛋白质供给水平上增加必需氨基酸的乳腺吸收和改变非必需氨基酸的吸收，导致可用于分解代谢的氨基酸减少[9]。论文网

    在猪、牛和小鼠的研究中表明氨基酸信号通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路传递[ 4-5，10 ]。mTOR信号通路[11]通过促进核糖体S6激酶1（S6K1）的磷酸化及真核起始因子4EBP1增加mRNA的翻译[12-14]。离体条件下，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸增加核糖体S6K1的磷酸化可诱导牛和小鼠乳腺上皮细胞蛋白质的合成，而向培养基中添加赖氨酸、组氨酸和苏氨酸会抑制S6K1的激活[15]。亮氨酸和异亮氨酸激活MAC-T细胞中的mTOR（牛乳腺细胞）。最近的研究工作表明，异亮氨酸和苏氨酸积极影响着mTOR的磷酸化[16]。然而，氨基酸激活mTORC1的传递机制还不太清楚。氨基酸转运已经提出了作为感受器就像载体一样进行组织营养供应[17]。酵母的SSY1是氨基酸通透酶家族的一个成员，虽然具有调节细胞外氨基酸的基因转录，但缺乏运输氨基酸进入细胞的能力。以前的研究结果表明mTORC1信号作用可能的是膜受体。

    首次在菌状味蕾的味觉神经元上发现G蛋白偶联受体（GPCR）复合体T1R1/T1R3是一种氨基酸的受体[20]。T1R1/T1R3的功能是作为氨基酸感受器并且通过Gα的N1E-115细胞亚单位激活细胞内的信号转导途径[21]。也有报道，这些受体调节氨基酸肠内分泌细胞中的胰高血糖素样肽-1、GLP-2和胆囊收缩素的分泌[21-22]。最近的一项研究发现T1R1/T1R3在小鼠组织、人类胰岛和许多 

类型的细胞中广泛表达[24]。抑制T1R1/T1R3表达导致翻译起始和通过mTOR信号通路的β细胞的胰岛素含量的减少[24]。这表明T1R1/T1R3受体的功能可能是作为供给状态下和氨基酸可用时的一个直接传感器[25]。本研究的目的是探讨乳腺上皮细胞中T1R1/T1R3前mTOR信号通路的氨基酸的传感功能，并探讨其对乳蛋白合成的影响。文献综述

2、材料与方法

2。1、材料

  胰岛素、氢化可的松、表皮生长因子（EGF），氨基酸转运蛋白抑制剂（BCH）；L-谷氨酸γ-（对硝基苯胺）盐酸盐（GPNA），和氨基酸均购自Sigma。催乳素是提取于细胞因子。山羊抗β-酪蛋白（sc-17969）是从圣克鲁斯生物科技购买。兔anti-t1r1（ab79248）和兔anti-T1R3（ab74732）均购自Abcam。兔抗mTOR（# 2972），兔抗pmTOR（S（2448）# 2971），兔anti-S6K（# 9202），鼠标anti-pS6K(T389）(# 9206），兔anti-p4EBP1(T37／46）(#2855）和兔anti-4EBP1 (#9644)均购自 Cell Signaling。小鼠单克隆抗-抗-肌动蛋白抗体和辣根过氧化物酶结合抗鼠抗体也购自Sigma。