2 材料与方法

2。1 材料

阳性质粒DNA (含有NOS终止子基因）和待测样品由中国农业科学院国家检测中心提供，阴性常规种由淮阴师范学院刘乃森老师提供。

2。2 试剂与耗材

定性PCR所用Taq酶、dNTP、MgCl2、定量PCR所用2× GoldStar  TaqMan Mixture(with ROX)、电泳液和Lodding Buffer由自己配制、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2。3 仪器设备 

 普通PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽和电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2。4 方法

2。4。1 DNA的提取与纯化 

本研究使用改进的CTAB法对小麦基因组总DNA进行抽提，实验步骤如下：

（1）将小麦颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取0。 2 g粉末装入 2mL离心管中。

（2）立即加入600μl已经预热到65℃的2×CTAB，混合均匀。

（3）将离心管转入65℃水浴，温浴40min，温浴过程中颠倒混匀数次。

（4）加入等体积（600μl）的氯仿:异丙醇（24:1）。

（5）颠倒混匀30分钟，室温4000rpm离心20分钟。

（6）取上清（约500μl）于新的1。5ml离心管中，加入等体积（500μl）的酚:氯仿:异丙醇（25:24:1）。

（7）颠倒混匀5分钟，室温4000rpm离心20分钟。

（8）取上清（约400μl）于新的1。5ml离心管中，加入200μl含有RNA酶的1M NaCl溶液。

（9）加入2/3体积（400μl）已预冷的异丙醇，混匀，—20℃放置30分钟，或更长或过夜沉淀DNA。

（10）4000rpm离心10分钟，弃上清，在吸水纸上放置1分钟，吸干水。文献综述

（11）加入500μl75％的乙醇清洗DNA，洗涤至少20分钟，4000rpm离心10分钟，弃上清。

（12）重复步骤11，弃上清后置于超净台吹干。

（13）用100μl的超纯水溶解DNA，—20℃储存备用

2。4。2引物及探针序列

本研究使用的引物和探针是国家转基因检测标准使用的引物和探针，本实验通过上海捷瑞生物工程有限公司合成，其序列详见下表。

2。4。3 PCR检测 

（1）定性PCR扩增

 PCR又称聚合酶链式反应，是一种体外扩增技术，在引物、模板DNA和核苷酸存在的条件下，进行酶促反应，使特定的DNA片段在数量上呈指数增加的技术，该技术能在短时间内获得大量的特定基因片段。 本研究根据实验室的一贯实验习惯，采用25ul反应体系进行PCR扩增，具体反应体系如下：

按照上述反应体系设两个对照实验。以含有目标基因的质粒作阳性对照，以水作空白对照，反应体系配制完成后置于ABI公司生产的GeneAmp PCR System 9700 PCR仪上进行PCR扩增，根据引物退火温度及扩增片段的大小设定扩增反应条件，详见表4。

PCR反应结束后，对PCR反应产物进行电泳分析，分析使用的为1%的琼脂糖胶，将1%的琼脂糖在电泳液中充分溶解后制胶，待胶凝固后取6ul待检测的PCR产物置于点样孔中，以Super Maker做分子量标记，在180V电压下恒压电泳30分钟，电泳结束后将琼脂糖胶置于EB染液中进行染色3分钟，然后用清水缓慢冲洗凝胶5分钟，以便洗去表面的EB染料，将清洗干净的琼脂糖胶置于凝胶成像系统观察。

（2）定量PCR扩增

荧光定量PCR是一种自动化程度较高的全闭管检测，这种方法一定程度上避免了交叉污染。近年来，已经开发出的荧光染料有SYBR Green I、TaqMan等几种，被广泛地应用于检测研究，其中TaqMan探针法在转基因检测中应用最广泛[10-12]。TaqMan技术是在普通PCR扩增系统中，加入一个与目的基因序列特异互补的双荧光标记探针，通过检测荧光信号而达到实时监控PCR反应进程的目的。本试验对待测冬小麦的荧光定量PCR检测是通过定量的检测方法进行定性判断。