（2）DNA聚合酶为Fastpfu酶的扩增

Fastpfu酶保真性较高，虽然 Taq酶价格便宜、易出结果，但是它不具有3'→5'的外切酶活性，易导致扩增过程中碱基错配，从而引起基因突变。Taq酶可用于进行PCR摸索条件的实验，条件确定之后再改为Fastpfu酶，既保证扩增效率，又提高了保真性，可以合成较少的特异性弱的产物；正确率较高。PCR体系（25µL）为： 18。3 µL的H2O，2。5µL 10×（Fastpfu）buffer，1µL的dNTP，1 µL的基因组DNA，0。5µL的cel3c-Act-F，0。5µL的cel3c-R和0。2 µL的Fastpfu酶。PCR反应程序为：94℃，2min预变性后。94℃，20s变性，60℃ ，20s退火，72℃ ，1min40s延伸，三步为一个循环，进行30个循环后，72℃延伸5 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。具体电泳方法为：切下所需孔数的凝胶，放入电泳槽中，孔在负极（黑色）端点样待样品中蓝色走到胶的2/3处时，停止电泳。取出凝胶，放入含EB的buffer里染色2min，在紫外灯下观察跑胶结果。PCR体系多做几组，以备回收目的基因DNA所用。

（3）琼脂糖凝胶回收cel3c的DNA（exDNA导纳凝胶回收试剂盒）

在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶并切碎，计算凝胶重量（提前记录1。5ml离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100l体积）。加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均和后75℃加热，间断混合，直至凝胶块完全熔化。再加0。5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。加Buffer DE-B的混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。接着将混合液转移到DNA制备管，将其置于2ml离心管中，9000r离心1min，弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加500L Buffer W1，9000r离心30s，弃滤液。将制备管置回2ml离心管，加700L Buffer W2，9000r离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700l Buffer W2洗涤一次，9000r离心1min。将制备管置回2ml离心管中，9000r离心2min。最后将制备管置于干净的1。5ml离心管中，在制备膜中央加30LTE，室温静置1min，9000r离心1min洗脱DNA。

回收结束后用Nanodrop法测回收DNA浓度。其方法步骤为：打开电脑，选择Nanodrop2000程序软件，待初始化完成后选择“Nuclear acid”，再初始化。在仪器的加样处加入3µL TE Buffer，洗涤。再加入1。5ml TE Buffer合上盖子。点击“Blank”选项，进行校零。用纸轻轻吸干样品孔的TE buffer，再加入1µL待测DNA溶液，盒盖，点击“Measure”电脑即可生成测量结果（绿色框中），观察DNA纯度。

2。Pact的扩增

（1）引物设计

根据Pact的DNA片段序列，设计引物为cel3c-Act-R和XbaI-F，XbaI-F的引物序列是TATATATATCTAGAC ACAGCAGAAGGGGGTTCCGTCAAC。其中双下划线标记基因是XbaI限制性内切酶的识别位点。Cel3c-Act-R的引物序列是TCAGCCATTGTGACTGA

TTAATGTATGAAGCTGATGAAAG。其中粗虚下划线标记基因是cel3c的基因，下划线为Pact的基因序列。引物cel3c-Act-R和XbaI-F均为赛百盛基因技术有限公司合成。

（2） DNA聚合酶为Fastpfu酶的PCR论文网

同Cel3c PCR方法一致，先用Taq验证条件，然后将Taq酶换成Fastpfu酶。PCR体系（25µL）为：17。3 µL的H2O，2。5µL10×（Fastpfu）bµffer，1µLdNTP，3 µL的基因组DNA，0。5µL的cel3c-Act-F，0。5µL的cel3c-R和0。4 µL的Fastpfu酶。PCR反应程序为：94℃，4 min预变性后。94℃，20s变性，60℃ ，40s退火，70℃，1min延伸，三步为一个循环，进行30个循环后，72℃延伸5 min。重复上述步骤多次，将所得到的启动子PCR片段跑胶回收。

（3）琼脂糖凝胶回收Pact的DNA

步骤见2。2。1cel3c (3)中的相关步骤，然后测量DNA浓度。