(2)DNA聚合酶为Fastpfu酶的扩增

Fastpfu酶保真性较高,虽然 Taq酶价格便宜、易出结果,但是它不具有3'→5'的外切酶活性,易导致扩增过程中碱基错配,从而引起基因突变。Taq酶可用于进行PCR摸索条件的实验,条件确定之后再改为Fastpfu酶,既保证扩增效率,又提高了保真性,可以合成较少的特异性弱的产物;正确率较高。PCR体系(25µL)为: 18。3 µL的H2O,2。5µL 10×(Fastpfu)buffer,1µL的dNTP,1 µL的基因组DNA,0。5µL的cel3c-Act-F,0。5µL的cel3c-R和0。2 µL的Fastpfu酶。PCR反应程序为:94℃,2min预变性后。94℃,20s变性,60℃ ,20s退火,72℃ ,1min40s延伸,三步为一个循环,进行30个循环后,72℃延伸5 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。具体电泳方法为:切下所需孔数的凝胶,放入电泳槽中,孔在负极(黑色)端点样待样品中蓝色走到胶的2/3处时,停止电泳。取出凝胶,放入含EB的buffer里染色2min,在紫外灯下观察跑胶结果。PCR体系多做几组,以备回收目的基因DNA所用。

(3)琼脂糖凝胶回收cel3c的DNA(exDNA导纳凝胶回收试剂盒)

在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶并切碎,计算凝胶重量(提前记录1。5ml离心管重量),该重量作为一个凝胶体积(如100mg=100l体积)。加入3个凝胶体积的Buffer DE-A,混合均和后75℃加热,间断混合,直至凝胶块完全熔化。再加0。5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B,混合均匀。加Buffer DE-B的混合物颜色变为黄色,充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。接着将混合液转移到DNA制备管,将其置于2ml离心管中,9000r离心1min,弃滤液。将制备管置回2ml离心管,加500L Buffer W1,9000r离心30s,弃滤液。将制备管置回2ml离心管,加700L Buffer W2,9000r离心30s,弃滤液。以同样的方法再用700l Buffer W2洗涤一次,9000r离心1min。将制备管置回2ml离心管中,9000r离心2min。最后将制备管置于干净的1。5ml离心管中,在制备膜中央加30LTE,室温静置1min,9000r离心1min洗脱DNA。

回收结束后用Nanodrop法测回收DNA浓度。其方法步骤为:打开电脑,选择Nanodrop2000程序软件,待初始化完成后选择“Nuclear acid”,再初始化。在仪器的加样处加入3µL TE Buffer,洗涤。再加入1。5ml TE Buffer合上盖子。点击“Blank”选项,进行校零。用纸轻轻吸干样品孔的TE buffer,再加入1µL待测DNA溶液,盒盖,点击“Measure”电脑即可生成测量结果(绿色框中),观察DNA纯度。

2。Pact的扩增

(1)引物设计

根据Pact的DNA片段序列,设计引物为cel3c-Act-R和XbaI-F,XbaI-F的引物序列是TATATATATCTAGAC ACAGCAGAAGGGGGTTCCGTCAAC。其中双下划线标记基因是XbaI限制性内切酶的识别位点。Cel3c-Act-R的引物序列是TCAGCCATTGTGACTGA

TTAATGTATGAAGCTGATGAAAG。其中粗虚下划线标记基因是cel3c的基因,下划线为Pact的基因序列。引物cel3c-Act-R和XbaI-F均为赛百盛基因技术有限公司合成。

(2) DNA聚合酶为Fastpfu酶的PCR论文网

同Cel3c PCR方法一致,先用Taq验证条件,然后将Taq酶换成Fastpfu酶。PCR体系(25µL)为:17。3 µL的H2O,2。5µL10×(Fastpfu)bµffer,1µLdNTP,3 µL的基因组DNA,0。5µL的cel3c-Act-F,0。5µL的cel3c-R和0。4 µL的Fastpfu酶。PCR反应程序为:94℃,4 min预变性后。94℃,20s变性,60℃ ,40s退火,70℃,1min延伸,三步为一个循环,进行30个循环后,72℃延伸5 min。重复上述步骤多次,将所得到的启动子PCR片段跑胶回收。

(3)琼脂糖凝胶回收Pact的DNA

步骤见2。2。1cel3c (3)中的相关步骤,然后测量DNA浓度。

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