NaCl                          10g

Agar（琼脂）                   10g

定量称取上述物质于量筒中，加纯水搅拌至完全溶解，定容至1000mL。用PH计调pH调至7。4。分装至锥形瓶，之后用封口膜封口。在高温高压条件(121℃，110kPa)下灭菌20 min。

（5）CMC（羧甲基纤维素钠）产孢培养基（1000mL）

NH4NO3                                1g

KH2PO3                              1g

MgSO4·7H2O              0。5g

Yeast extract（酵母提取物）    1g

CMC                        15g

定量称取上述物质于量筒中，加纯水搅拌至完全溶解，定容至1000mL。分装至锥形瓶，之后用封口膜封口。在高温高压条件(121℃，110kPa)下灭菌20 min。

（7）RM培养基（1000mL）

Cascin hydrolysate（酪蛋白水解物）   1g

Yeast extract（酵母提取物）          1g

  Sucrose（蔗糖）                    274g

定量称取上述物质于量筒中，加纯水搅拌至完全溶解，定容至1000mL。用PH计调pH调至7。5。分装至锥形瓶，之后用封口膜封口。在高温高压条件(121℃，110kPa)下灭菌20 min。

（8）YEPD培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Broth）（1000mL）

Peptone          10 g

Yeast extract        3 g

Glucose          20 g

定量称取上述物质于量筒中，加纯水搅拌至完全溶解，定容至1000mL。用PH计调pH调至7。5。分装至锥形瓶，之后用封口膜封口。在高温高压条件(121℃，110kPa)下灭菌20 min。

1。2。2抗生素

表1 抗生素及其使用浓度

Table 1  Antibiotics and the application concentration

抗生素 缩写 使用浓度μg/ml

氨苄 Amp 100

潮霉素 HPH 100

1。3  实验试剂及器材

1。3。1实验试剂

质粒提取试剂盒购丁贝生物科技有限公司Plasmid Mini KitⅠ（200）；切胶回收试剂盒购于OMEGA公司Gel Extraction Kit（200）；酵母质粒提取试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司； 

1。3。2实验器材

超速离心机、涡旋振荡仪、PCR仪、超净工作台、高温高压灭菌锅、90℃烘箱、37℃培养箱、25℃ 培养箱、4℃冰箱、恒温震荡摇床、磁力搅拌器、微波炉、电子天平、恒温水浴锅、金属浴、电泳仪、PH计、-70℃冰箱、血细胞计数器。

2 方法

2。1 FvSet1的敲除载体构建

基因敲除通过同源重组双交换的方法。利用LFH（Long Flanking Homology）PCR获得含有上游片段-潮霉素-下游片段的融合PCR片段，以Fv102为受体菌株，并将融合片段直接进行 PEG 介导的原生质转化，利用潮霉素抗性筛选转化子。

2。1。1同源臂扩增