(PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)标准50μl体系:

5×PrimeSTAR® Buffer(Mg2+ plus) 5μl

dNTP Mixture 2μl

PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 1μl

DNA template 1μl

Primer F 1μl

Primer R 1μl

dd H20         39μl

重叠PCR体系:

5×PrimeSTAR® Buffer(Mg2+ plus) 5μl

dNTP Mixture 1μl

PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 1μl

左臂 1μl

潮霉素片段 3μl

右臂 1μl

dd H20         13μl

2。1。2 PEG介导的轮枝镰孢菌原生质转化

2。1。2。1分生孢子制备

接种CM平板上的Fv102菌饼到装有100ml CMC产孢培养液的250ml锥形瓶中,在25℃,180rpm震荡摇床中光照培养4天后用三层无菌擦镜纸过滤,滤液在室温下7000rpm离心20min,弃上清,孢子沉淀再用无菌水悬浮混匀收集孢子备用。论文网

2。1。2。2幼殖体制备

将孢子调至1×107cells,吸取1ml接种到含100ml YEPD液体培养基的250ml锥形瓶中,在25℃,180 rpm震荡摇床上培养16小时,用无菌三层擦镜纸过滤幼殖体,用0。7MNaCl溶液冲洗多次,再用灭菌牙签将冲洗好的幼殖体转移到灭菌的空50ml锥形瓶中待用。

2。1。2。3原生质体制备

    配制轮枝镰孢菌细胞壁裂解酶液,用Millipore 0。45μm无菌滤器过滤酶解液,将过滤好的酶解液加入到装有幼殖体的50ml锥形瓶中(每1g幼殖体加入20ml酶解液),放入28℃,150 rpm震荡摇床中裂解2。5-3h。待充分裂解后,用无菌三层擦镜纸过滤混合液到无菌的50ml离心管中,并用0。7M NaCl冲洗,将尽可能多的原生质体洗下来,所得滤液4℃,5000rpm离心10min,弃上清,加入5ml 0。7MNaCl 轻微的重新悬浮原生质沉淀,之后分装到2ml离心管中,4℃,5000rpm离心2min,弃上清,沉淀用600μl STC溶液缓慢的吸打混匀,逐滴加入200μl的SPTC溶液,置于冰上待用。

2。1。2。4原生质体转化

将1ml的原生质体悬浮液、50-100μl敲除载体、5μl肝素钠(5mg/ml)加入管中,轻轻吸打混匀。冰上避光静置30min。逐滴加入400μl SPTC,轻轻吸打混匀,室温避光静置20min。将混合液加入含有20 ml RM培养基的50ml锥形瓶中,缓慢混匀,将三角瓶置于25℃,100 rpm震荡摇床中避光过夜培养。第二天待原生质体恢复成细小的菌丝后加入到含有潮霉素或者G418的PDA培养基中,倒平板,在25℃恒温培养箱中培养三天,挑取转化子并鉴定。

2。1。3钢珠法小量粗提基因组DNA

(1)在平板上挑取新鲜菌丝0。1g左右,置于2 ml灭菌离心管中;

(2)在装有菌丝的离心管中加入600μl左右的DNA裂解液(DNA lysis buffer ),加研磨大钢珠和小钢珠各1颗;

(3)将2 ml离心管加入样品研磨器中, 65HZ震荡1 min;

(4)研磨好的样品静置5 min后于4℃,冷冻离心机中13200 rpm离心10 min以上;

(5)吸取上清液到新的离心管中,加入无水乙醇750μl,缓慢的颠倒混匀;

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