（PrimeSTAR® HS DNA Polymerase）标准50μl体系：

5×PrimeSTAR® Buffer（Mg2+ plus） 5μl

dNTP Mixture 2μl

PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 1μl

DNA template 1μl

Primer F 1μl

Primer R 1μl

dd H20         39μl

重叠PCR体系：

5×PrimeSTAR® Buffer（Mg2+ plus） 5μl

dNTP Mixture 1μl

PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 1μl

左臂 1μl

潮霉素片段 3μl

右臂 1μl

dd H20         13μl

2。1。2 PEG介导的轮枝镰孢菌原生质转化

2。1。2。1分生孢子制备

接种CM平板上的Fv102菌饼到装有100ml CMC产孢培养液的250ml锥形瓶中，在25℃，180rpm震荡摇床中光照培养4天后用三层无菌擦镜纸过滤，滤液在室温下7000rpm离心20min，弃上清，孢子沉淀再用无菌水悬浮混匀收集孢子备用。论文网

2。1。2。2幼殖体制备

将孢子调至1×107cells，吸取1ml接种到含100ml YEPD液体培养基的250ml锥形瓶中，在25℃，180 rpm震荡摇床上培养16小时，用无菌三层擦镜纸过滤幼殖体，用0。7MNaCl溶液冲洗多次，再用灭菌牙签将冲洗好的幼殖体转移到灭菌的空50ml锥形瓶中待用。

2。1。2。3原生质体制备

    配制轮枝镰孢菌细胞壁裂解酶液，用Millipore 0。45μm无菌滤器过滤酶解液，将过滤好的酶解液加入到装有幼殖体的50ml锥形瓶中（每1g幼殖体加入20ml酶解液），放入28℃，150 rpm震荡摇床中裂解2。5-3h。待充分裂解后，用无菌三层擦镜纸过滤混合液到无菌的50ml离心管中，并用0。7M NaCl冲洗，将尽可能多的原生质体洗下来，所得滤液4℃，5000rpm离心10min，弃上清，加入5ml 0。7MNaCl 轻微的重新悬浮原生质沉淀，之后分装到2ml离心管中，4℃，5000rpm离心2min，弃上清，沉淀用600μl STC溶液缓慢的吸打混匀，逐滴加入200μl的SPTC溶液，置于冰上待用。

2。1。2。4原生质体转化

将1ml的原生质体悬浮液、50-100μl敲除载体、5μl肝素钠（5mg/ml）加入管中，轻轻吸打混匀。冰上避光静置30min。逐滴加入400μl SPTC，轻轻吸打混匀，室温避光静置20min。将混合液加入含有20 ml RM培养基的50ml锥形瓶中，缓慢混匀，将三角瓶置于25℃，100 rpm震荡摇床中避光过夜培养。第二天待原生质体恢复成细小的菌丝后加入到含有潮霉素或者G418的PDA培养基中，倒平板，在25℃恒温培养箱中培养三天，挑取转化子并鉴定。

2。1。3钢珠法小量粗提基因组DNA

（1）在平板上挑取新鲜菌丝0。1g左右，置于2 ml灭菌离心管中；

（2）在装有菌丝的离心管中加入600μl左右的DNA裂解液(DNA lysis buffer )，加研磨大钢珠和小钢珠各1颗；

（3）将2 ml离心管加入样品研磨器中， 65HZ震荡1 min；

（4）研磨好的样品静置5 min后于4℃，冷冻离心机中13200 rpm离心10 min以上；

（5）吸取上清液到新的离心管中，加入无水乙醇750μl，缓慢的颠倒混匀；