（6）12000 rpm，4℃离心5 min；

（7）弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，倒扣离心管30min，干燥后用50-100μlddH2O溶解，溶解液即为轮枝镰孢菌基因组DNA。

2。2 FvSet1的回补载体构建

在neo基因前加上trpC启动子，采用抗生素G418作为抗性筛选标记。设计引物扩增全长，连接到pCAMBIA1300质粒上，得到pCAMBIA1300-neo载体。Fv102、∆FvSet1为受体菌株，进行回补。

2。2。1引物设计与合成

本实验使用Web Primer redesign survey软件，设计Set1-GFP-F和Set1-GFP-R的引物。

2。2。2扩增片段及鉴定

以Fv102基因组DNA为模板，以Set1-GFP-F和Set1-GFP-R为引物，用Phanta Max Super-Fidelity超保真聚合酶对Set1-GFP基因进行PCR扩增，得到PCR产物。

Phanta Max Super-Fidelity PCR反应体系(50μl体系)

2×Phanta Max Buffer     25μl

dNTP          1μl

Set1-GFP-F       1μl

Set1-GFP-R       1μl

模板           1μl

ddH2O         20μl 

Phanta Max Super-Fidelity   1μl

PCR产物（每管加5μl 10×Loading Buffer）鉴定：

将电泳槽洗干净，倒入缓冲液（原液：纯水=1:50）；将制胶槽置于水平位置，将制胶板放置在固定位置，准备好梳子；称取0。3g琼脂于锥形瓶中，加30g缓冲液，放入微波炉加热2min左右直至溶液沸腾、透明，将其取出，用流水冲洗锥形瓶外壁，使之冷却到50℃，加入1μlYeaRed核酸染料，摇匀；然后将琼脂凝胶液小心地倒入制胶板（制胶槽）上，使整个制胶板（制胶槽）均匀铺满凝胶液，无气泡，再插入事先准备好的梳子；室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直拔掉梳子，将整个制胶板放入电泳槽中，确保缓冲液没过凝胶；向每个样品小槽中加7-8μl样品；接通电源，计时约25min，电泳结束后，取出凝胶，采用凝胶成像系统拍照保存。文献综述

2。2。3 切胶回收 

提前打开55℃、65℃、37℃水浴锅。

（1）切胶，紫外灯下将含有DNA片段的胶块切碎后放入2ml离心管中；

（2）加入Binding Buffer（XP2），55℃，水浴20-30min直至胶完全溶解；

（3）加入700μlDNA液体到粉色吸附柱里，12000rpm离心1min，弃废液。（若还有DNA液体，继续加入同一吸附柱中，离心，弃废液）；全部转移过后，将吸附柱插入冰中几分钟，可提高回收效率（可省略）；

（4）向吸附柱中加入300μl Binding Buffer（XP2），12000rpm离心1min，弃废液；

（5）向吸附柱中加入SPW Wash Buffer,12000rpm离心1min，弃废液；

（6）重复（5）一次；

（7）空甩，13000rmp，3min，弃废液；

（8）将吸附柱倒置，静置10min，挥发乙醇；

（9）将吸附柱放入1。5ml离心管中，向吸附膜正中央悬空滴加30-50μl ddH2O（65℃预热）；

（10）放置37℃，10min，高温洗脱；

（11）12000rpm离心1min。

2。2。4酵母转化及鉴定

提前打开30℃、42℃水浴锅。准备灭过菌的玻璃棒若干。

（1）在一个1。5ml离心管中加入100μl酵母感受态，5μl载体DNA，5μl Histamine solution，10μl目的片段（1μl切胶回收后的酶切质粒+9μl目的片段），轻轻混匀，在25℃下培养15min；

（2）另取一个2。0ml离心管，加入0。8mlPEG和0。2mlTE/Cation MIXX,使用移液枪反复吸打或在涡旋仪上剧烈震荡，吸取1ml加入步骤（1）1。5ml离心管中，震荡均匀；

（3）在30℃水浴锅中培养10min；来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-