(6)12000 rpm,4℃离心5 min;

(7)弃上清,用70%乙醇洗涤沉淀,倒扣离心管30min,干燥后用50-100μlddH2O溶解,溶解液即为轮枝镰孢菌基因组DNA。

2。2 FvSet1的回补载体构建

在neo基因前加上trpC启动子,采用抗生素G418作为抗性筛选标记。设计引物扩增全长,连接到pCAMBIA1300质粒上,得到pCAMBIA1300-neo载体。Fv102、∆FvSet1为受体菌株,进行回补。

2。2。1引物设计与合成

本实验使用Web Primer redesign survey软件,设计Set1-GFP-F和Set1-GFP-R的引物。

2。2。2扩增片段及鉴定

以Fv102基因组DNA为模板,以Set1-GFP-F和Set1-GFP-R为引物,用Phanta Max Super-Fidelity超保真聚合酶对Set1-GFP基因进行PCR扩增,得到PCR产物。

Phanta Max Super-Fidelity PCR反应体系(50μl体系)

2×Phanta Max Buffer     25μl

dNTP          1μl

Set1-GFP-F       1μl

Set1-GFP-R       1μl

模板           1μl

ddH2O         20μl 

Phanta Max Super-Fidelity   1μl

PCR产物(每管加5μl 10×Loading Buffer)鉴定:

将电泳槽洗干净,倒入缓冲液(原液:纯水=1:50);将制胶槽置于水平位置,将制胶板放置在固定位置,准备好梳子;称取0。3g琼脂于锥形瓶中,加30g缓冲液,放入微波炉加热2min左右直至溶液沸腾、透明,将其取出,用流水冲洗锥形瓶外壁,使之冷却到50℃,加入1μlYeaRed核酸染料,摇匀;然后将琼脂凝胶液小心地倒入制胶板(制胶槽)上,使整个制胶板(制胶槽)均匀铺满凝胶液,无气泡,再插入事先准备好的梳子;室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直拔掉梳子,将整个制胶板放入电泳槽中,确保缓冲液没过凝胶;向每个样品小槽中加7-8μl样品;接通电源,计时约25min,电泳结束后,取出凝胶,采用凝胶成像系统拍照保存。文献综述

2。2。3 切胶回收 

提前打开55℃、65℃、37℃水浴锅。

(1)切胶,紫外灯下将含有DNA片段的胶块切碎后放入2ml离心管中;

(2)加入Binding Buffer(XP2),55℃,水浴20-30min直至胶完全溶解;

(3)加入700μlDNA液体到粉色吸附柱里,12000rpm离心1min,弃废液。(若还有DNA液体,继续加入同一吸附柱中,离心,弃废液);全部转移过后,将吸附柱插入冰中几分钟,可提高回收效率(可省略);

(4)向吸附柱中加入300μl Binding Buffer(XP2),12000rpm离心1min,弃废液;

(5)向吸附柱中加入SPW Wash Buffer,12000rpm离心1min,弃废液;

(6)重复(5)一次;

(7)空甩,13000rmp,3min,弃废液;

(8)将吸附柱倒置,静置10min,挥发乙醇;

(9)将吸附柱放入1。5ml离心管中,向吸附膜正中央悬空滴加30-50μl ddH2O(65℃预热);

(10)放置37℃,10min,高温洗脱;

(11)12000rpm离心1min。

2。2。4酵母转化及鉴定

提前打开30℃、42℃水浴锅。准备灭过菌的玻璃棒若干。

(1)在一个1。5ml离心管中加入100μl酵母感受态,5μl载体DNA,5μl Histamine solution,10μl目的片段(1μl切胶回收后的酶切质粒+9μl目的片段),轻轻混匀,在25℃下培养15min;

(2)另取一个2。0ml离心管,加入0。8mlPEG和0。2mlTE/Cation MIXX,使用移液枪反复吸打或在涡旋仪上剧烈震荡,吸取1ml加入步骤(1)1。5ml离心管中,震荡均匀;

(3)在30℃水浴锅中培养10min;来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-

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