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CaSR介导色氨酸诱导猪胃胃肠激素分泌的规律(2)
色氨酸(Trp)不仅是人体必需氨基酸之一,也是猪的第四限制性必需氨基酸,
国内外
学者对其都有大量研究,发现色氨酸及其代谢产物5-羟色胺与动物采食量、免疫、抗应激等生理反应密切相关[4]。
钙(Ca)是机体内最重要的矿物元素之一,在各项生理活动中都处于必不可缺的地位,参与一切生命活动,例如文系细胞的正常生理功能,文持细胞膜两侧
生物
电位正常,文持神经及神经-肌肉传导功能和正常的肌肉伸缩与舒张功能。自Brown等[5]首次于牛甲状旁腺细胞中克隆出钙敏感受体(CaSR)后,在人的甲状旁腺和大鼠肾脏中也发现了CaSR的表达[6-8], CaSR能被激活后,能够启动与其有关的信号通路,进一步调控细胞的增殖与分化和多种激素的分泌。
目前关于氨基酸和蛋白质对肠胃中CaSR的表达及影响方面的研究在家畜和其他动物上还比较少,对机体各项生命活动的调控作用也尚不明确。为此,本课题设计不同浓度色氨酸,通过不同条件的体外灌流实验,测定胃窦生长抑素、胃泌素分泌活性,揭示CaSR介导色氨酸诱导猪胃窦胃肠激素SS、gastrin分泌的规律 为后继续研究CaSR调节动物生理活动相关的机制及其发挥的生理功能奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 建立表面灌流系统
表面灌流装置参照谈寅飞[9]等人的方法并加以改进而成(如图1-1),该系统包括氧气瓶、储液瓶、恒流泵、灌流小室、恒温水浴锅、收集器、烧杯和硅胶管8个部分。 灌流小室(如图1-2)是由5mL的一次性注射器改装而成,包括尼龙网(400目)、针头、橡胶塞和注射器4个部分。
图1-1:灌流系统 Superfusion system
1.氧气瓶 Oxygen pump; 2. 储液瓶Media reservoir; 3.恒流泵 Peristaltic pump; 4.灌流小室 Chamber;
5.玻璃管 Glass tube; 6.水浴锅 Water bath; 7.收集器 Collector. 8.硅胶管Silicone tube
图1-2:灌流小室 Chamber
1. 尼龙网(400目)Nylon filter platform 2. 针头Needle3. 橡胶塞 Rubber stoper 4. 注射器Syringe
1.2 试剂和仪器
Kreb’s 培养液;色氨酸(Trp)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自Sigma-Aldrich(中国,上海); cinacalcet和NPS2143均购自MedChem Express(中国,上海);猪生长抑素SS(ANG-E31118P,AOGENE)、胃泌素gastrin(ANG-E31183P,AOGENE)ELISA试剂盒购自南京奥青生物技术有限公司(中国,南京);
pH计;酶标仪(Thermo,USA);低温高速离心机(Eppendorf,Germany)。
1.3 样品处理
1.3.1 配置Kreb’s培养液 Kreb’s培养液(136.87 mM NaCl,4.02 mM KCl,2.10mM MgCl2,1.80 mM CaCl2,25.18mM HEPES,pH = 7.2)使用去离子水配置然后进行高压灭菌。各项试验均使用Kreb’s培养液作为基础液进行处理用作灌流液,分别按试验设计安排进行配制;对照组均使用Kreb’s培养液作为灌流液。
1.3.2 组织处理 将从屠宰场取来的新鲜胃组织剪取胃窦部分,于磷酸盐缓冲液(PBS)中洗去组织粘膜上附着物,剪碎,称量,用于后续灌流以及胃泌素、生长抑素分泌活性研究,将灌流前以及灌流后的组织置于冻存管中置于液氮中保存。
1.4 试验设计与样品收集
1.4.1 灌流实验 将洗净的胃组织全部剪成约1 mm2的组织块,混匀,称重,然后装入灌流小室中,每个灌流小室装400 mg。使用不含Trp的Kreb’s培养液进行预灌流,速度为6 mL/h,30分钟后使用刺激液进行灌流,并作为0 min,每隔20分钟收集一管灌流液,持续收集120分钟。在整个实验过程中,持续通入含5% CO2的O2,在灌流结束后,用-20℃和液氮保存所收集到的灌流液和胃窦组织块,待测。
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利用厌氧真菌和甲烷菌共培养体系研究三硝酸丙酸酯对厌氧真菌代谢的影响
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