怀牛膝茎叶多糖研究及生物活性研究(2)
对怀牛膝茎叶中的多糖目前研究比较少，怀牛膝多糖主要来自其根部。导致怀牛膝茎叶不能合理利用而大量浪费，所以本实验以怀牛膝的茎叶作为材料，研究其多糖含量、抑菌及抗氧化活性。多糖提取工艺的系统研究尚未有相关报道，本实验通过微波辅助提取和热水浸提两种方法来研究怀牛膝茎叶多糖的含量。并测定怀牛膝多糖提取液对超氧阴离子自由基（O2-•）和羟自由基（•OH）的清除率，研究怀牛膝多糖的抗氧化活性。进一步研究怀牛膝多糖对常见致病菌大肠杆菌、农杆菌的抑制作用。本实验结果将有利于怀牛膝多糖药理作用研究的发展，以期为更好地开发和利用怀牛膝多糖及探索“道地药材”的内在质量提供依据。
1.实验部分
1.1实验所用仪器及试剂
材料：怀牛膝茎叶。
试剂及药品：氯仿、正丁醇、乙醚、苯酚、盐酸、浓磷酸、双氧水、丙酮、乙醇、甲醇均为分析纯、葡糖糖、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、邻苯三酚、邻二氮菲、硫酸亚铁铵等。
仪器：S22pc可见分光光度计(上海凌光技术有限公司)；恒温水浴锅HH-S6（巩义市矛华仪器有限责任公司）；海尔冰箱BCD-215KCM（青岛海尔股份有限公司）；恒温振荡器LRH（上海一恒科学仪器有限公司）；系列生化培养箱THZ -98AB（昆山一恒仪器有限公司）；电子天平AL204（梅特勒托利多仪器上海有限公司）；HC-3018高速离心机（安徽中科中佳科学有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海恒科科技有限公司）；SYQ-DSX-280B不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海恒科科技有限公司）；SW-CJ-2FD型洁净操作台（苏州安泰空气技术有限公司）；SHB-III循环水式真空泵（郑州欧卡仪器设备有限公司)；微波炉（格兰仕微波炉电器有限公司）。
1.2怀牛膝茎叶多糖的提取及含量测定
本实验以蒸馏水作为溶剂，提取怀牛膝茎叶多糖。采用苯酚硫酸法[9]测定多糖的含量，以葡萄糖为标准品。苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定。
1.2.1怀牛膝茎叶多糖的提取工艺流程[12-13]
微波辅助提取法：干燥的牛膝茎叶→剪碎称取30 g→加入1:20的蒸馏水→在80 ℃温度下水浴浸泡2 h→微波提取一次→抽滤→微波提取一次→抽滤→合并提取液→按照5:1的比例在合并液中加入氯仿、正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=5:1）后充分摇匀（目的除去蛋白质）→离心（3000 r/min，10 min），取上清→烘箱浓缩→按照浓缩液与乙醇比为1:3的比例加入无水乙醇（使多糖沉淀）→搅拌均匀、静置过夜→离心（3000 r/min，15 min），取沉淀→用乙醚洗涤沉淀→牛膝多糖粗提物→加蒸馏水定融到50 mL容量瓶。
热水浸取法：干燥的牛膝茎叶→剪碎称取30 g→加入1:20的蒸馏水→在80 ℃温度下水浴浸泡24 h→抽滤→再次在80 ℃温度下水浴浸泡24 h→抽滤→合并提取液→按照5:1的比例在合并液中加入氯仿、正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=5:1）后充分摇匀（目的除去蛋白质）→离心（3000 r/min，10 min），取上清→烘箱浓缩→按照浓缩液与乙醇比为1:3的比例加入无水乙醇（使多糖沉淀）→搅拌均匀、静置过夜→离心（3000 r/min，15 min），取沉淀→用乙醚洗涤沉淀→牛膝多糖粗提物→加蒸馏水定融到50 mL容量瓶。
1.2.2葡萄糖标准溶液的配制
准确的称取0.1 g葡萄糖并用蒸馏水溶解定容至1000 mL，配制成100 μg/mL的标准溶液。
1.2.3标准曲线的绘制
准确的分别移取标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90 mL浓度为100 μg/mL的葡萄糖溶液，置于各个试管中，全部加蒸馏水补足至每试管1 mL，然后各加入1.00 mL的6%的苯酚溶液，摇均匀，再依次加入5 mL的98%浓硫酸，摇均匀，都要经过15 min的静止，置于温度为40 ℃的条件下30 min，取出冷却，于波长490 nm处测定吸光度D490nm，结果见如表1、图1。将待测试管中葡萄糖的浓度与吸光度作回归处理，得到回归方程y=0.0073x－0.0188。
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